[0025] 为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明优选实施方案进行描述，但是应当理解，这些描述只是为了进一步说明本发明的特征和优点，而不是对本发明权利要求的限制。
[0026] 本发明所有原料，对其来源没有特别限制，在市场上购买的或按照本领域技术人员熟知的常规方法制备的即可。
[0027] 本发明提供了一种含有激活因子的神经再生纳米纤维的制备方法，包括如下步骤：
[0028] S1：将壳聚糖和聚氧化乙烯完全溶解于乙酸溶液，搅拌均匀，得到纺丝液；
[0029] S2：采用所述纺丝液进行静电纺丝，得到壳聚糖/聚氧化乙烯纳米纤维；
[0030] S3：将所述壳聚糖/聚氧化乙烯纳米纤维用DMEM培养基洗涤至中性，烘干之后进行等离子处理活化得到活化纳米纤维；
[0031] S4：取小鼠肿瘤细胞液氮研磨后，经过0.22μm孔径膜过滤去除未破碎细胞，并用DNA酶进行消化反应，得到激活因子；
[0032] S5：将所述活化纳米纤维浸泡在含有神经生长因子和所述激活因子的DMEM培养基中进行负压闪爆，之后进行接枝反应，离心冻干，得含有激活因子的神经再生纳米纤维。
[0033] 首先，将壳聚糖和聚氧化乙烯完全溶解于乙酸溶液，搅拌均匀，得到纺丝液；本发明中壳聚糖和聚氧化乙烯均为本领域普通技术人员熟知的市售商品，壳聚糖优选选择粘均6
分子量为5.0×105、脱乙酰度90％的壳聚糖，聚氧化乙烯优选选择平均分子量为1.0×10的聚氧化乙烯。乙酸优选选择浓度为90％(v/v)的乙酸溶液。
[0034] 本发明中将壳聚糖和聚氧化乙烯完全溶解于乙酸溶液，搅拌均匀，得到的纺丝液中壳聚糖和聚氧化的的总浓度优选为10～30g/L，更优选为20g/L；壳聚糖与聚氧化乙烯的质量比优选为1:1～4，更优选为1:3。
[0035] 制备完纺丝液后，采用纺丝液进行静电纺丝，得到壳聚糖/聚氧化乙烯纳米纤维。本发明静电纺丝工艺中，使用的注射器规格为10ml，针头规格为平头，7号针；静电纺丝条件优选为，电压为12～20KV，更优选为15KV，距离7～10cm，更优选为8cm，进样速率0.3～
1.0ml/h，更优选为0.5ml/h，温度25～35℃，更优选为30℃。
[0036] 得到壳聚糖/聚氧化乙烯纳米纤维后，将壳聚糖/聚氧化乙烯纳米纤维用DMEM培养基洗涤至中性，烘干之后经等离子处理器处理活化得到活化纳米纤维。本发明中等离子处理处理活化的目的是使纤维可以更多的吸附神经生长因子和激活因子。洗涤终点pH优选为7，烘干的温度优选为37～45℃，更优选为37℃，烘干时间优选为2～4h，更优选为4h。等离子体处理的条件优选为：气体采用氮气或氧气，更优选为氧气，处理功率为250～300W，更优选为280W，压强为50～60Pa，更优选为55Pa，处理时间为10～15min，更优选为15min。
[0037] 然后制备激活因子。具体为：取小鼠肿瘤细胞液氮研磨后，经过0.22μm孔径膜过滤去除未破碎细胞，并用DNA酶进行消化反应后得到激活因子。本发明中小鼠肿瘤细胞优选采用Colon 26小鼠结肠癌细胞、KLN205小鼠肺癌鳞癌细胞、LL/2小鼠Lewis肺癌细胞、Neuro‑2a小鼠脑神经母细胞瘤、B16小鼠黑色素瘤细胞、J558小鼠多发性骨髓瘤细胞和RM1小鼠前
4
列腺癌细胞中的一种。DNA酶与细胞量的比优选为400～5000U:1×10个，更优选为2000U:1
4
×10 个，所述消化反应温度优选为30～40℃，更优选为37℃，消化时间优选为2～4h，更优选为3h。
[0038] 得到活化纳米纤维和激活因子后，将神经生长因子NGF、细胞培养添加剂和激活因子加入DMEM培养基，得到含有含有神经生长因子和激活因子的DMEM培养基，然后将活化纳米纤维浸泡在含有神经生长因子和激活因子的DMEM培养基中进行负压闪爆，之后进行接枝反应，离心冻干，得到含有激活因子的神经再生纳米纤维。
[0039] 本发明中所制备的含有神经生长因子和激活因子的DMEM培养基中NGF的浓度优选为40～80mg/L，更优选为80mg/L，细胞培养添加剂的浓度优选为20～40ml/L，更优选为40mg/L。本发明中细胞培养添加剂优选采用B27。激活因子浓度以蛋白计优选为90～400mg/L，更优选为300mg/L。本发明中，接枝反应的浸泡浴比优选为1:100～300，更优选为1:200，浸泡温度优选为0～4℃，更优选为4℃，浸泡时间优选为12～24h，更优选为24h；所述负压闪爆的真空度优选为0.100～0.024mBar，更优选为0.024mBar；所述冻干的温度优选为‑30～‑
20℃，更优选为‑30℃，真空度优选为0.100～0.024mBar，更优选为0.024mBar，冻干时间优选为3～5d，更优选为4d。
[0040] 为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明提供的一种含有激活因子的神经再生纳米纤维的制备方法进行详细说明，本发明的保护范围不受以下实施例的限制。
[0041] 实施例1
[0042] S1、将0.5g粘均分子量为5.0×105、脱乙酰度90％的壳聚糖和1.5g平均分子量为6
1.0×10的聚氧化乙烯完全溶解于100ml 90％(v/v)乙酸溶液，搅拌均匀，得到纺丝液；
[0043] S2、采用纺丝液进行静电纺丝，使用的注射器规格为10ml，针头规格为平头，7号针；静电纺丝条件为，电压15KV，距离8cm，进样速率0.5ml/h，温度30℃得到壳聚糖/聚氧化乙烯纳米纤维；
[0044] S3、将壳聚糖/聚氧化乙烯纳米纤维用DMEM培养基洗涤至pH为7，37℃烘4h之后经等离子处理器处理活化，等离子体处理的条件为：气体采用氧气，处理功率为280W，压强55Pa，处理时间为15min；
[0045] S4、取小鼠Neuro‑2a脑神经母细胞瘤细胞液氮研磨后，经过0.22μm孔径膜过滤去4
除未破碎细胞，并以2000U:1×10个的比例用DNA酶消化，消化温度37℃，消化时间3h，得到激活因子；
[0046] S5、将步骤S3得到的纳米纤维浸泡在含有80mg/L NGF、40mg/L B27和300mg/L(以蛋白计)激活因子的DMEM培养基中进行负压闪爆，负压闪爆的真空度为0.024mBar，之后进行接枝反应，接枝反应的浸泡浴比为1:200，浸泡温度为4℃，浸泡时间为24h；将完成接枝反应的纳米纤维离心之后冻干，温度为‑30℃，真空度为0.024mBar，冻干时间为4d，即得含有激活因子的神经再生纳米纤维。
[0047] 实施例2
[0048] S1、将0.5g粘均分子量为5.0×105、脱乙酰度90％的壳聚糖和0.5g平均分子量为6
1.0×10的聚氧化乙烯完全溶解于100ml 90％(v/v)乙酸溶液，搅拌均匀，得到纺丝液；
[0049] S2、采用纺丝液进行静电纺丝，使用的注射器规格为10ml，针头规格为平头，7号针；静电纺丝条件为，电压15KV，距离8cm，进样速率0.5ml/h，温度30℃得到壳聚糖/聚氧化乙烯纳米纤维；
[0050] S3、将壳聚糖/聚氧化乙烯纳米纤维用DMEM培养基洗涤至pH为7，37℃烘4h之后经等离子处理器处理活化，等离子体处理的条件为：气体采用氧气，处理功率为280W，压强55Pa，处理时间为15min；
[0051] S4、取小鼠B16黑色素瘤细胞液氮研磨后，经过0.22μm孔径膜过滤去除未破碎细4
胞，并以400U:1×10个的比例用DNA酶消化，消化温度30℃，消化时间2h，得到激活因子；
[0052] S5、将步骤S3得到的纳米纤维浸泡在含有80mg/LNGF、40mg/L B27和90mg/L(以蛋白计)激活因子的DMEM培养基中进行负压闪爆，负压闪爆的真空度为0.024mBar，之后进行接枝反应，接枝反应的浸泡浴比为1:200，浸泡温度为4℃，浸泡时间为24h；将完成接枝反应的纳米纤维离心之后冻干，温度为‑30℃，真空度为0.024mBar，冻干时间为4d，即得含有激活因子的神经再生纳米纤维。
[0053] 实施例3
[0054] S1、将0.6g粘均分子量为5.0×105、脱乙酰度90％的壳聚糖和2.4g平均分子量为6
1.0×10的聚氧化乙烯完全溶解于100ml 90％(v/v)乙酸溶液，搅拌均匀，得到纺丝液；
[0055] S2、采用纺丝液进行静电纺丝，使用的注射器规格为10ml，针头规格为平头，7号针；静电纺丝条件为，电压15KV，距离8cm，进样速率0.5ml/h，温度30℃得到壳聚糖/聚氧化乙烯纳米纤维；
[0056] S3、将壳聚糖/聚氧化乙烯纳米纤维用DMEM培养基洗涤至pH为7，37℃烘4h之后经等离子处理器处理活化，等离子体处理的条件为：气体采用氧气，处理功率为280W，压强55Pa，处理时间为15min；
[0057] S4、取小鼠RM1前列腺癌细胞液氮研磨后，经过0.22μm孔径膜过滤去除未破碎细4
胞，并以5000U:1×10个的比例用DNA酶消化，消化温度40℃，消化时间3h，得到激活因子；
[0058] S5、将步骤S3得到的纳米纤维浸泡在含有80mg/L NGF、40mg/L B27和400mg/L(以蛋白计)激活因子的DMEM培养基中进行负压闪爆，负压闪爆的真空度为0.024mBar，之后进行接枝反应，接枝反应的浸泡浴比为1:200，浸泡温度为4℃，浸泡时间为24h；将完成接枝反应的纳米纤维离心之后冻干，温度为‑30℃，真空度为0.024mBar，冻干时间为4d，即得含有激活因子的神经再生纳米纤维。
[0059] 对比例1：
[0060] S1、将0.5g粘均分子量为5.0×105、脱乙酰度90％的壳聚糖和1.5g平均分子量为6
1.0×10的聚氧化乙烯完全溶解于100ml 90％(v/v)乙酸溶液，搅拌均匀，得到纺丝液；
[0061] S2、采用纺丝液进行静电纺丝，使用的注射器规格为10ml，针头规格为平头，7号针；静电纺丝条件为，电压15KV，距离8cm，进样速率0.5ml/h，温度30℃得到壳聚糖/聚氧化乙烯纳米纤维；
[0062] S3、将壳聚糖/聚氧化乙烯纳米纤维用DMEM培养基洗涤至pH为7，37℃烘4h之后经等离子处理器处理活化，等离子体处理的条件为：气体采用氧气，处理功率为280W，压强55Pa，处理时间为15min；
[0063] S4、将步骤S3得到的纳米纤维浸泡在含有80mg/L NGF和40mg/L B27的DMEM培养基中进行负压闪爆，负压闪爆的真空度为0.024mBar，之后进行接枝反应，接枝反应的浸泡浴比为1:200，浸泡温度为4℃，浸泡时间为24h；将完成接枝反应的纳米纤维离心之后冻干，温度为‑30℃，真空度为0.024mBar，冻干时间为4d。
[0064] 对比例2：
[0065] 1、将0.5g粘均分子量为5.0×105、脱乙酰度90％的壳聚糖和1.5g平均分子量为6
1.0×10的聚氧化乙烯完全溶解于100ml 90％(v/v)乙酸溶液，搅拌均匀，得到纺丝液；
[0066] 2、采用纺丝液进行静电纺丝，使用的注射器规格为10ml，针头规格为平头，7号针；静电纺丝条件为，电压15KV，距离8cm，进样速率0.5ml/h，温度30℃得到壳聚糖/聚氧化乙烯纳米纤维；
[0067] 3、将壳聚糖/聚氧化乙烯纳米纤维用DMEM培养基洗涤至pH为7.2，37℃烘4h之后经等离子处理器处理活化，等离子体处理的条件为：气体采用氧气，处理功率为280W，压强55Pa，处理时间为15min；
[0068] 4、将步骤三得到的纳米纤维浸泡在含有80mg/LNGF和40mg/L B27的DMEM培养基中，之后进行接枝反应，接枝反应的浸泡浴比为1:200，浸泡温度为4℃，浸泡时间为24h；
[0069] 5、将完成接枝反应的纳米纤维离心，离心重力加速度为10000g，时间10min，之后冻干，温度为‑30℃，真空度为0.024mBar，冻干时间为4d。
[0070] 对比例3：
[0071] 1、将0.5g粘均分子量为5.0×105、脱乙酰度90％的壳聚糖和1.5g平均分子量为6
1.0×10的聚氧化乙烯完全溶解于100ml 90％(v/v)乙酸溶液，搅拌均匀，得到纺丝液；
[0072] 2、采用纺丝液进行静电纺丝，使用的注射器规格为10ml，针头规格为平头，7号针；静电纺丝条件为，电压15KV，距离8cm，进样速率0.5ml/h，温度30℃得到壳聚糖/聚氧化乙烯纳米纤维；
[0073] 3、将壳聚糖/聚氧化乙烯纳米纤维用DMEM培养基洗涤至pH为7，37℃烘4h；
[0074] 4、将步骤三得到的纳米纤维浸泡在含有80mg/LNGF和40mg/L B27的DMEM培养基中进行负压闪爆，负压闪爆的真空度为0.024mBar，之后进行接枝反应，接枝反应的浸泡浴比为1:200，浸泡温度为4℃，浸泡时间为24h；
[0075] 5、将完成接枝反应的纳米纤维离心，离心重力加速度为10000g，时间10min，之后冻干，温度为‑30℃，真空度为0.024mBar，冻干时间为4d。
[0076] 将实施例与对比例的纳米纤维放入培养皿中，进行常规的神经元培养。经72h培养后，显微计数神经元个数，测定神经细胞增殖率，结果如图1所示。由图1可知，实施例处理条件下的神经元细胞增殖率明显高于对比例。因此，本发明实施例与对比例相比能够显著促进神经元的增殖。
[0077] 以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征和本发明的优点，对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。
