[0014] 以下实施例旨在说明本发明而不是对本发明的进一步限定。
[0015] 实施例1
[0016] 按照丹参︰五味子︰山慈姑︰桑葚提取物=3︰1︰1︰1的重量比例进行混合后研磨成粉，干燥后抽真空包装保存。在育肥猪屠宰上市前连续使用本发明1个月，具体使用方法是在日粮中直接添加，添加比例是0.5～1%，注意搅拌均匀。其中桑葚提取物购自宁波杰顺生物科技有限公司（其花青素的质量含量为25%）。
[0017] 实施例2
[0018] 按照丹参︰五味子︰山慈姑︰桑葚提取物=3︰1︰1︰1的重量比例进行混合后研磨成粉，采用乙醇提取，用水沉淀，过滤，滤液真空干燥，粉碎后得到的粉末真空包装保存。在育肥猪屠宰上市前连续使用本发明1个月，具体使用方法是在饮水中直接添加溶解，添加比例是每只猪日饮水量12-15kg的0.05～0.1%，注意混合均匀。其中桑葚提取物购自宁波杰顺生物科技有限公司（其花青素的质量含量为25%）。
[0019] 实施例3
[0020] 按照丹参︰五味子︰山慈姑︰桑葚提取物=4︰2︰1︰1的重量比例进行混合后研磨成粉，干燥后抽真空包装保存。在育肥猪屠宰上市前连续使用本发明40天，具体使用方法是在日粮中直接添加，添加比例是0.8%，注意搅拌均匀。其中桑葚提取物购自安康东科麦迪森天然药业有限公司（其花青素的质量含量为20%）。
[0021] 实施例4
[0022] 按照丹参︰五味子︰山慈姑︰桑葚提取物=4︰3︰2︰2的重量比例进行混合后研磨成粉，干燥后抽真空包装保存。在育肥猪屠宰上市前连续使用本发明40天，具体使用方法是在日粮中直接添加，添加比例是1%，注意搅拌均匀。其中桑葚提取物购自安康东科麦迪森天然药业有限公司（其花青素的质量含量为20%）。
[0023] 实施例5
[0024] 按照丹参︰五味子︰山慈姑︰桑葚提取物=4︰2︰1︰1的重量比例进行混合后研磨成粉，采用乙醇提取，用水沉淀，过滤，滤液真空干燥，粉碎后得到的粉末真空包装保存。在育肥猪屠宰上市前连续使用本发明40天，具体使用方法是在饮水中直接添加溶解，添加比例是每只猪日饮水量12-15kg的0.08%，注意混合均匀。其中桑葚提取物购自吉林省隆泽生物工程有限责任公司（其花青素的质量含量为20%）。
[0025] 实施例6
[0026] 按照实施例1的方法配置本发明，按照不同比例添加在饲喂高铜日粮的肥育猪饲料中。共分为4个实验组，每组肥育猪10只，分别为对照组（添加比例为0%）、低剂量组（添加本发明产品比例0.25%）、中剂量组（添加本发明产品比例为0.5%）、高剂量组（添加本发明产品比例1%），连续添加1个月，进行如下实验，观察本发明对肥育猪体内铜蓄积量、肝功能及氧化损伤的影响：
[0027] 1.材料与方法
[0028] 1.1血清ALT、AST活性的检测
[0029] （1）血清ALT检测
[0030] ①标本的采集和保存采血后，析出血清。血清标本于4℃冰箱恒温过夜，在1000g离心20min，取血清用于相关指标的检测，溶血标本不宜进行此项检测。
[0031] ②操作步骤
[0032] 各试剂在使用前平衡至25℃。
[0033] a.每次检测时分别设空白、标准和待测样品孔并向酶标板中加样。除设置的空白孔外，其余各孔分别加入标准溶液或与处理好的样品100ul，轻轻混匀，酶标板加上盖，防止气泡产生，37℃反应120min。
[0034] b.弃去上述液体，滤纸或卫生纸上拍干，不洗涤。
[0035] c.每孔加检测溶液A工作液100ul，37℃，60min。洗板3次，350ul/每孔，滤纸或卫生纸上拍干。
[0036] d.每孔加检测溶液B工作液100ul，37℃，60min，洗板5次，滤纸或卫生纸上拍干。
[0037] e.37℃避光进行显色反应，防止显色物见光分解30min，依序每孔加底物溶液90ul，有明显的蓝色梯度。
[0038] f.每孔加入50ul终止溶液，使得反应终止，蓝色转为黄色。用AT585酶标仪在450nm波长测量各孔的OD值。
[0039] ③计算
[0040] 以标准物的浓度为横坐标，OD值为纵坐标，在EXCEL内以标准物的浓度与OD值计算出标准曲线的方程式，根据样品的OD值由标准曲线计算相应的浓度。
[0041] （2）血清AST检测
[0042] ①标本的采集及保存
[0043] 采血后，用EDTA或肝素作为抗凝剂，标本采集后30min内于1000g离心15min，取上清即可检测。
[0044] ②操作步骤
[0045] a.使用前各试剂均应平衡至25℃，检测试剂在4℃进行溶解，因其热稳定性差不能直接在37℃溶解；加样时每块酶标板分别设置空白孔、标准孔和待测样品孔。空白孔内只加入样品工作液100μl而不加入其它液体，其结果作为空白对照，其余各孔则分别加入100μl的标准品或待测样品，加样时要防止液体内部产生气泡，将样品加于酶标板底部或先加入稀释液，用酶标仪震荡或轻轻晃动混匀，酶标板加上盖或覆膜，37℃条件下温育2h反应终止。弃去液体，滤纸或卫生纸上拍干，注意无需洗涤。每孔加100μl于实验开始时配制的检测溶液A工作液，再加上覆膜于酶标板上，37℃孵育1h。
[0046] b.小心甩去孔内液体，在卫生纸上反复拍干，共洗涤3次，每次浸泡1-2min，大约400μl/每孔。
[0047] c.每孔加100μl实验开始前配制的检测溶液B工作液，盖上覆膜，37℃条件下，温育1h。
[0048] d.洗板5次，滤纸或卫生纸上拍干，弃去孔内液体，方法与步骤3相同。
[0049] e.上述操作完成后，在每孔中加入90μl底物溶液，于酶标板盖上覆膜37℃，显色反应应避光进行（防止显色物见光分解），反应时间应控制在15-30min内最易（肉眼观察发现标准孔的前4-5孔有明显的梯度蓝色可终止反应）。加入底物后每隔10min进行一次肉眼观察，注意反应孔的颜色变化。根据反映情况应加入终止液使得显色反应及时终止，避免因为反应过强而导致AT585酶标仪读取的OD值不准确。
[0050] f.上述操作完成后加入终止液终止反应，终止液的加入顺序应尽量与底物液的加入顺序相同。反应液加入后反应体系中的液体由蓝色立转黄色。
[0051] g.各孔的OD值应在酶标仪校准后，在450nm波长处进行读取。
[0052] ③计算
[0053] 以标准品的浓度为纵坐标（对数坐标），根据样品值，由EXCEL绘制标准曲线制并求得方程，并将样品OD值带入后计算，最终结果应乘以稀释倍数。
[0054] 检测范围：1.56U/L-100U/L，绘制标准曲线请取用以下浓度值：100U/L，50U/L，25U/L，12.5U/L，6.25U/L，3.12U/L，1.56U/L。
[0055] 1.2肝脏Cu含量检测
[0056] ①组织匀浆的准备:准确称取组织重量，按照重量体积比加入9倍生理盐水制成10%的匀浆，2000～2500r/min，离心10min，取上清液俺以下方法进行检测：
[0057] ②试剂：
[0058] 试剂I：HAC-NaAC缓冲液
[0059] 试剂II：5-Br-PADAP显色液
[0060] 铜校准品：31.4μmol/L Cu2+
[0061] ③测定步骤
[0062] a.工作液配制：根据需要，临用时将试剂I和试剂II 1：20混合。
[0063] b.测定参数：波长：546nm；光径：1.0cm；温度：37℃。
[0064] c.加样方法：
[0065] 空白管（μL）：蒸馏水12（μL），反应试剂100（μL）
[0066] 校准管（μL）：标准液12（μL），反应试剂100（μL）
[0067] 测定管（μL）：样本12（μL），反应试剂100（μL）
[0068] 混匀后，37℃反应15分钟，蒸馏水调零，读取各孔吸光度计算：
[0069] 铜含量（mmol/L）=[（A标本-A空白）/（A校准-A空白）]×校准值1.3肝脏内BCA、CAT、GSH、SOD、MDA的测定
[0070] （1）肝脏总蛋白测定BCA
[0071] ①6ml BCA Reagent与120μl Cu Protein混合，配置成WRI工作液；
[0072] ②标准曲线绘制：40μl（4000ug/ml BSA）加入到40μl（PBS）制备成BSA浓度为2000μg/ml的溶液80μl。取40μl连续倍比稀释7次制备成为BSA标准品，其浓度为：2000，1000，500，250，125，62.5，31.25μg/ml，各40μl。取10μl×3孔每浓度，加入至酶标板内。
[0073] ④10μl标准品或待测样品与200μl WRI工作液混合后加入96孔板。37℃反应30min；
[0074] ⑤冷却至室温后用562nm测量各孔OD值；
[0075] ⑥取标准品的平均值绘制标准曲线，EXCEL内计算斜率和公式，Y轴为BSA标准浓度μg/ml，X轴为标准空对应的OD值。
[0076] ⑦将各组样品的OD值带入到公式中得出相应浓度值。
[0077] （2）肝脏CAT含量测定
[0078] ①组织样品的制备：
[0079] 于200μL裂解液中加入10mg肝脏样品的进行匀浆，之后12000g，4℃离心5min，上清可用于后续测定，以上操作需在冰上完成。
[0080] ②标准曲线测定的准备：
[0081] 标准溶液用稀释液倍比稀释成100、50、20、10、5、2、1μmol/L，初次测定后知道样品的浓度范围后可以对标准品在样品浓度范围附近密集检测。
[0082] ③过氧化氢浓度的测定：
[0083] a.在冰上将过氧化氢检测试剂溶解。
[0084] b.在酶标板的检测孔加入样品或标准品50μL。
[0085] c.每孔内再加入过氧化氢检测试剂100μL。
[0086] d.轻轻振荡，室温（15-30℃）放置30min。然后于酶标仪A560处检测吸光度。
[0087] e.绘制标准曲线，计算样品中过氧化氢的浓度。
[0088] （3）肝脏组织GSH含量测定
[0089] ①检测试剂：
[0090] a.GSSG储备液：5mg GSSG溶解至816μl超纯水中，混匀，使得终浓度为10mM。未用完的GSSG储备液分装后放置于-80℃保存备用。
[0091] b.DTNB储备液：4.5mg DTNB溶解于1.5ml DMSO，溶解后混匀，取需要部分后，剩余DTNB储备液分装至-80℃保存。
[0092] c.NADPH储备液：4mg NADPH溶解至100μl超纯水，混匀后备用，取需要部分后，剩余NADPH至于-84℃保存。
[0093] d.谷胱甘肽还原酶工作液：取1μl谷胱甘肽还原酶（GSSG），加入39μl总谷胱甘肽检测缓冲液，混匀后备用。
[0094] e.谷胱甘肽检测工作液配置：根据待测样品数进行配置见下表。
[0095] 表1谷胱甘肽检测工作液配置
[0096]
[0097] f.0.16mg/ml NADPH工作液：取2μl NADPH储备液，再加入总谷胱甘肽检测缓冲液500μl，混匀后得到0.16mg/ml NADPH，50μl工作液可以检测一个样品。
[0098] g.GSH清除辅助工作液：47μl超超纯水加入53μl GSH清除辅助储备液，混匀后备用。GSH清除辅助工作液不稳定，临用前现配。
[0099] h.GSH清除剂工作液：89.2μl无水乙醇加入到10.8μl GSH清除试剂中，立即混匀。注意的是GSH清除剂工作液不稳定，需现配现用。
[0100] ②标准品制备
[0101] 10mM GSSG储备液加入蛋白去除剂M溶液稀释成15μM、10μM、5μM、2μM、1μM、0.5μM GSSG溶液。根据上述溶液绘制6点标准曲线。GSSG在蛋白去除剂M内不稳定，需临用前现配。
[0102] ③待测组织样品制备
[0103] a.组织样品用PBS清洗离心后去上清。
[0104] b.研磨器研磨后加入3倍与沉淀体积的蛋白去除剂M。
[0105] c.液氮与37℃水浴2次，4℃冰浴5min。
[0106] d.4℃离心10000g持续10min。取上清，用于测定细胞总给谷胱甘肽。用于立即测定的样品与4℃保存。样品可在-70℃存储10d。
[0107] ④待测GSSG样品制备
[0108] a.取上述细胞样品，以样品：GSH清除辅助剂=20：1的比例加入GSH清除辅助液，震荡混匀。再以20：1的比例加入GSH清除工作液震荡混匀。
[0109] b.25℃反应60min。
[0110] ⑤96孔板点样与动力学测定
[0111] a.按照下表，依次加入相应的标准品或样品，混合均匀后再加入总谷胱甘肽检测工作液150μl，混匀，室温下孵育5min。
[0112] 表2谷胱甘肽检测
[0113]
[0114] b.酶标仪在A412处每5min测定一次，共测定5次。
[0115] ⑥GSSG与GSH含量计算
[0116] 根据相应时间点读取对应的吸光度值从而计算出△A412/min。以标准品浓度为横坐标、△A412/min为纵坐标，绘制标准曲线并求得相应的方程式从，通过待测样品的吸光度值计算出每mg组织中GSH或GSSG的含量。
[0117] （4）肝脏组织总SOD活力测定
[0118] 以1：9的比例用生理盐水稀释肝组织，手动连续10次匀浆（匀浆过程应在冰浴中完成）。取肝匀浆0.3ml，加入1.0ml硫巴比妥酸（0.67%，TBA）再加入20.5ml的三氯醋酸（20%），沸水中反应30min，随后置于流水下冷却至室温，放于离心机中5000r/min，离心10min，取上清液于535nm比色，读取OD值。
[0119] ①样品的准备：
[0120] 组织样品的准备：动物用生理盐水（0.9%NaCl，含有0.16mg/ml肝素钠）灌流清除血液后获取组织样品。取适量的组织样品，加入细胞裂解液进行匀浆。将匀浆产物置于4℃离心，吸取上清作为待测样，整个操作宜在冰浴上进行。用BCA蛋白浓度检测试剂盒确定样品的蛋白浓度。制备好的样品如果当日就能完成测定，可以放置于冰浴中保存，如果当天不能完成，可以置于-70℃保存。
[0121] ②试剂盒的准备工作：
[0122] a.WST工作液的配制：按照每10μLWST-1加入到1.8ml SOD检测缓冲液的比例进行配制，注意混匀。
[0123] b.酶工作液的配制：按照每10μL酶溶液加入到200μL工作液中的比例进行配制，混匀后即为酶工作液，注意应该应充分混匀。
[0124] ③样品测定：
[0125] a.以下表为参考标准使用96孔板设置各空白对照孔和样品孔，依次加入相应的待测样品和其他各种溶液（加入酶工作液后应充分混匀）。
[0126] 表3SOD活力的检测
[0127]
[0128] b.37℃孵育20min。（说明：孵育20min至30min检测出来的SOD活力无显著差异）[0129] c.放置于分光光度计中于450nm处测定吸光度。
[0130] ④样品中总SOD活力的计算：
[0131] 抑制百分率的计算：
[0132] 抑制百分率＝[（空白对照A1-空白对照A2）-（样品A-空白对照A3）]/（空白对照A1-空白对照A2）×100%
[0133] OD酶活力的计算公式：
[0134] 待测样品中SOD酶活力单位＝检测体系中SOD酶活力单位＝抑制百分率/（1-抑制百分率）units。
[0135] （5）肝脏组织MDA含量测定
[0136] 将10%的肝脏组织匀浆先稀释10倍，之后取0.1ml的匀浆稀释液加入到样品管中，于对照管和样品管中则分别加入0.6与0.5ml蒸馏水。各管加入试剂1（黄嘌呤1.0mol/L，盐酸羟胺1.0mol/L）、试剂2（黄嘌呤氧化酶10U/mL），充分混匀，置于37℃水浴上，反应30min后，再加入试剂3[含7712μmol/L盐酸萘乙二胺的16%（体积比）冰乙酸溶液和含
512mmol/L对氨基苯磺酸的16%（体积比）冰乙酸溶液等体积混合]。室温反应44min，调零，于分光光度计550nm波长处比色测定各管吸光度。
[0137] ①样品的准备：
[0138] a.待测组织使用RIPA+PMSF（100：1）处理，组织重量应占裂解液的比例为10%；裂解后，置于离心机中，1600g离心10min，吸取上清用于后续检测，样品制备步骤宜在冰浴上完成。
[0139] ②试剂盒的准备工作：
[0140] a.TBA储存液的配制：称取18.5mg的TBA，用5ml的TBA配制液溶解即获得浓度为0.37％的TBA储存液。配置好的TBA储存液应在室温下避光保存，3个月都可使用。
[0141] b.MDA检测工作液的配制：根据待测定的样品数（含对照），参考以下表格在检测前现配先用适量的MDA检测工作液。
[0142] c.标准品的稀释：取适量标准品用蒸馏水倍比稀释至50、20、10、5、2、1μM。
[0143] ③样品测定：
[0144] a.参考下表设置检测反应体系，在1.5ml离心管内加入0.1ml裂解液作为空白对照，加入0.1ml上述稀释后的标准品用于制作标准曲线，加入0.1ml样品用于相关的测定；随后加入丙二醛检测工作液0.2ml：
[0145] 表4MDA含量的检测
[0146]
[0147] b.混匀后，置于水浴锅沸水浴加热15min，在离心管盖子上用针头刺一小孔。
[0148] c.水浴完成后冷却至室温，随后置于离心机中1000g，离心10min。于酶标板的每孔中加入200μL上清液，随后用分光光度计在532nm处测定吸光度，同时以450nm为参考波长进行双波长测定。
[0149] d.MDA含量的计算：计算出样品溶液中MDA含量后，通过单位重量的蛋白含量来进行校准。
[0150] 2.结果与分析
[0151] 2.1丹参复合制剂对血清中ALT、AST活性的影响
[0152] 添加本发明后，与对照组比较，各丹参复合物添加组AST、ALT活性均有显著的降低（P<0.01），提示丹参复合物在一定剂量范围内能明显降低育肥猪血清ALT、AST的活性（见表5），改善肝功能。
[0153] 表5丹参复合物对肥育猪ALT、AST的影响
[0154]
[0155] 与对照组相比，*P<0.05，**P<0.01；下同
[0156] 2.2丹参复合制剂对肝内Cu含量的影响
[0157] 表6丹参复合物对肝内Cu含量的影响
[0158]
[0159] 添加本发明后，与对照组比较，各丹参复合物添加组肝脏中的铜含量均有显著降低（P<0.01），提示丹参能明显促进肝脏中铜的外排。
[0160] 2.3丹参复合制剂对肝脏氧化损伤的保护作用
[0161] 添加本发明后，与对照组比较，各丹参复合物添加组动物肝脏中SOD活性均有显著的升高（P<0.01）。提示本发明能明显提高长时间采食高铜饲料肥育猪肝脏中SOD的活性（见表7）。
[0162] 添加本发明后，与对照组比较，各丹参复合物添加组动物肝脏中CAT活性均有显著的升高（P<0.05或P<0.01）。提示本发明能明显提高长时间采食高铜饲料肥育猪肝脏中CAT的活性（见表7）。
[0163] 添加本发明后，与对照组比较，各丹参复合物添加组动物肝脏中GSH含量均有显著的升高（P<0.05或P<0.01）。提示本发明能明显提高长时间采食高铜饲料肥育猪肝脏中GSH的含量（见表7）。
[0164] 添加本发明后，与对照组比较，各丹参复合物添加组动物肝脏中MDA含量均明显的降低（P<0.05或P<0.01）。提示本发明能明显提高长时间采食高铜饲料肥育猪肝脏中MDA的含量（见表7）。
[0165] 表7丹参复合物肥育猪肝脏氧化损伤相关指标的影响
[0166]
