[0041] 以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
[0042] 实施例1
[0043] 1、海洋真菌Phomopsis lithocarpus FS508的分离纯化和鉴定
[0044] 本发明的海洋真菌Phomopsis lithocarpus FS508是2016年5月，从印度洋深海沉积物(16°50.508'N,111°53.335'E，水深3606米)中分离得到的，经ITS序列分析鉴定，GenBank基因登录号为：MG686131，经blast比对，同源分析，鉴定该菌株属于Phomopsis属真菌，命名为Phomopsis lithocarpus FS508，其于2018年8月15日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，其保藏编号为GDMCC No.60433。
[0045] 2、Phomopsis lithocarpus FS508的固体发酵
[0046] 将活化的深海真菌FS508菌丝接种于马铃薯葡萄糖液体培养基(每升培养基是通过以下方法配制的：用500mL的纯水煮200g的马铃薯，煮沸20min，过滤得马铃薯汁，再加入葡萄糖20g、KH2PO4 3g、MgSO4 1.5g、维生素B1 10mg，用水补足至1000mL，灭菌制得)中，在28℃、120r/min条件下培养5天，制得种子液，然后将种子液按0.1mL/g大米培养基的接种量接种于大米培养基(该培养基是通过以下方法配制的：将480g大米与600mL质量体积比为0.5％mg/ml的粗海盐水溶液混合，121℃高压灭菌20min，冷却，制得)中，28℃条件下培养30天，制得FS508的固体发酵培养物。
[0047] 3、化合物lithocarpinol A和lithocarpinol B的制备
[0048] (1)往FS508的固体发酵培养物中加入乙酸乙酯，浸泡提取24小时，重复提取3次，提取液经浓缩后得浸膏(99.8g)；浸膏经体积分数为80％的甲醇水溶液分散，再用石油醚萃取四次，除去脂溶性成分，将萃取剩下的甲醇水溶液部分蒸馏浓缩得到粗提物。
[0049] (2)将步骤(1)得到的粗提物过硅胶柱层析，用石油醚-乙酸乙酯以体积比为10:1,7:1,9:2,2:1,1:1,0:1和二氯甲烷-甲醇以体积比为5:1,0:1分别作为洗脱剂，梯度洗脱，收集流分经TLC板合并相同主点得到14个组分，分别为Fr.1-Fr.14，将组分Fr.6(Fr.6为石油醚：乙酸乙酯＝2:1v/v洗脱获得的流分经进一步TLC薄层层析以正己烷：乙酸乙酯＝5:1v/v展开得Rf＝0.2-0.4的组分)再经凝胶柱层析Sephadex LH-20，以二氯甲烷-甲醇体积比1:1作为洗脱剂洗脱，经TLC板合并主点得到3个亚组分，分别为Fr.6.1-Fr.6.3；其中，得到的亚组分Fr.6.2(Fr.6.2为TLC薄层层析以正己烷：乙酸乙酯＝2:1v/v展开得Rf＝0.5-0.8的组分)的重量为2.2g，将亚组分Fr.6.2再经硅胶柱(200-300目)层析，以石油醚-乙酸乙酯的体积比为6:1,3:1,2:1,1:1,1:2,0:1梯度洗脱得到5个组分，分别为Fr.6.2.1-Fr.6.2.5；其中，得到的组分Fr.6.2.1(Fr.6.2.1为石油醚：乙酸乙酯＝6:1v/v洗脱得到的组分)的重量为1.2g，将组分Fr.6.2.1经全制备HPLC在YMC-ODS柱，流动相为体积比85:15的甲醇/水，流速为8mL/min的色谱条件下得到四个组分，分别为Fr.6.2.1.1-Fr.6.2.1.4；组分Fr.6.2.1.1(保留时间为8.0分钟)经进一步的半制备HPLC，在YMC-pack ODS/AQ柱，流动相为体积比82:18的乙腈/水，流速为3mL/min，保留时间为9.3min的色谱条件下得到化合物1(化合物lithocarpinol A，12.6mg)；组分Fr.6.2.1.2(保留时间为8.9分钟)经进一步的半制备HPLC，在YMC-pack ODS/AQ柱，流动相为体积比82:18的乙腈/水，流速为3mL/min，保留时间为9.4min的色谱条件下得到化合物2(化合物lithocarpinol B，10.1mg)。
[0050] 4、化合物lithocarpinol A和lithocarpinol B的结构鉴定
[0051] 1H NMR、13C NMR、HMBC核磁共振谱图用Bruker Advance-600核磁共振光谱仪测定，以四甲基硅烷(TMS)为内标；ESI-MS数据用VG Autospec-3000型质谱仪测定；紫外光谱用岛津UV-2600分光光度计测定，其结构鉴定如下：
[0052] 如图2-19所示，图2是化合物1(lithocarpinol A)的1H-NMR谱；图3是化合物1(lithocarpinol A)的13C-NMR谱；图4是化合物1(lithocarpinol A)的COSY谱；图5是化合物1(lithocarpinol A)的HSQC谱；图6是化合物1(lithocarpinol A)的HMBC谱；图7是化合物1(lithocarpinol A)的NOESY谱；图8是化合物1(lithocarpinol A)的HR-ESIMS谱；图9是化合物1的红外谱图；图10是化合物1的紫外谱图。
[0053] 图11是化合物2(lithocarpinol B)的1H-NMR谱；图12是化合物2(lithocarpinol B)的13C-NMR谱；图13是化合物2(lithocarpinol B)的COSY谱；图14是化合物2(lithocarpinol B)的HSQC谱；图15是化合物2(lithocarpinol B)的HMBC谱；图16是化合物2(lithocarpinol B)的NOESY谱；图17是化合物2(lithocarpinol B)的HR-ESIMS谱；图18是化合物2的红外谱图；图19是化合物2的紫外谱图。
[0054] 化合物1为白色固体；根据其ESIMS准分子离子峰，确定化合物1的分子量为424；根据HRESIMS[M-H]-m/z 423.1815，C25H27O6，计算值为423.1813，确定化合物的分子式为C25H28O6，不饱和度为12；13C-NMR谱显示有25个碳信号(表2)，包括4个甲基，2个亚甲基，7个甲基以及12个季碳(包括一个羰基碳)，进一步通过分析化合物1的二维谱确定了其平面结构。
[0055] 化合物2为白色固体；根据其ESIMS准分子离子峰，确定化合物1的分子量为424；根据HRESIMS[M+Na]+m/z 447.1777，C25H28NaO6，计算值为447.1778，确定化合物的分子式为C25H28O6，不饱和度为12；通过分析其1D和2D谱图发现化合物2的谱图与化合物1的谱图具有极大的相似度，化合物2应具有化合物1相同的母核结构，通过仔细分析化合物2的HMBC和COSY相关谱图推测出化合物2为化合物1的差向异构体。当尝试对化合物1和化合物2进行单晶培养时，一直得不到合适的晶型，但是当将其1:1混合，用甲醇做溶剂时，获得了两者的混晶，晶体结构见图1所示，确定了其相对构型。进一步通过ECD计算，从而确定了化合物1和2的绝对构型分别为8R,12S,9'S和8S,12R,9'S。
[0056] 表2化合物1和2的核磁数据(CD3COOD3,600MHz/150MHz,δin ppm,J in Hz)[0057]
[0058]
[0059] 经过上述方法分离的目标化合物1和2分别命名为化合物lithocarpinol A和lithocarpinol B，其结构式如式(II)所示：
[0060]
[0061] 实施例2
[0062] 采用SRB法(Skehan P,Storeng R,Dominic S.New colorimetric cytotoxicity assay for anticancer-drug screening[J].J Natl Cance Inst,1990,82:1107–1112.)测试化合物lithocarpinol A和lithocarpinol B的抗肿瘤活性。
[0063] 1、试验用试剂：将本发明制备的化合物lithocarpinol A和lithocarpinol B用二甲基亚砜(DMSO)溶解得浓度为10mg/mL的母液，再用RPMI-1640培养基稀释至所需浓度。阳性对照为顺铂水溶液。
[0064] 本实验所用肿瘤细胞株为肝癌细胞HepG-2、乳腺癌细胞MCF-7、神经胶质瘤细胞SF-268和非小细胞肺癌细胞A549。
[0065] 2、实验方法：取对数生长期的HepG-2、MCF-7、SF-268和A549细胞，用胰酶消化，台盼蓝染色计数，台盼蓝排斥实验检测细胞活力大于95％后，用新鲜RPMI-1640培养基调整细胞浓度为3×104个/mL，细胞接种于96孔板，每孔加入180μL的细胞悬液，并设3个空白孔调零，于37℃、5％CO2培养箱培养24h。待细胞贴壁后，每孔加入20μL一定浓度的上述化合物lithocarpinol A和lithocarpinol B的溶液，阴性对照加20μL RPMI-1640培养基，以顺铂作阳性对照。置于37℃、5％CO2培养箱中培养72h后，加入50μL体积分数为50％的冷三氯醋酸水溶液固定细胞，4℃放置1h后用蒸馏水洗涤5次，空气中自然干燥。然后加入由体积分数1％冰醋酸水溶液配制的磺酰罗丹明B(Sulforhodamine B，SRB)4mg/mL溶液100μL/孔，室温中染色30min，去上清，用1％冰醋酸洗涤5次，空气干燥。最后加入200μL/孔，浓度为10mmol/mL的Tris溶液，用酶标仪测定570nm处的吸光值(A)，用以下公式计算药物对细胞生长的抑制率：细胞生长抑制率(％)＝(1-A样品组/A对照组)×100％。
[0066] 3、实验结果：本发明制备的化合物lithocarpinol A和lithocarpinol B对四株肿瘤细胞的细胞毒性如表1所示。此结果表明：本发明的化合物lithocarpinol A和lithocarpinol B具有比较显著的抗肿瘤活性，因此，本发明为研究与开发新的抗肿瘤药物提供了候选化合物，为开发利用深海微生物来源的天然活性物质提供了科学依据。
[0067] 表1化合物lithocarpinol A和lithocarpinol B的对癌细胞的抑制效果[0068]
[0069] 以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，上述优选实施方式不应视为对本发明的限制，本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的精神和范围内，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
