[0028] 下面结合实施例进一步说明本发明的实质性内容,但并不以此限定本发明保护范围。尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明,本领域的普通技术人员应当理解,可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换,而不脱离本发明技术方案的实质和范围。
[0029] 实施例1:6-APA的制备
[0030] 将浓度为100000U/mL的青霉素发酵液1000mL放置在温度控制在30~34℃的搅拌反应器中,搅拌。待发酵液的温度达到30~34℃时,加入青霉素酰化酶60g(酶活120U/g)和如下结构所示的青霉素酰化酶激活剂5mg,进行裂解,并在裂解过程中不断滴加浓度为10%的氨水,将反应器中pH值维持在7.6左右,当停止加入氨水后20min内反应器中pH值保持不变时,反应结束。
[0031] 将裂解反应后的混合液依次经过10微米的过滤器、1微米的过滤器除去固体的青霉素菌丝。然后再将混合溶液依次经过截留分子量为30000~50000道尔顿的超滤器和截留分子量为3000~5000道尔顿的超滤器,除去大分子蛋白质等杂质。
[0032] 将除杂后的混合溶液经过截留分子量为100~260道尔顿的纳滤器,使混合溶液得到浓缩,浓缩至6-APA的质量浓度为10%。
[0033] 利用活性炭、三氧化二铝等将浓缩液脱色,得到脱色后的混合液。
[0034] 利用特定选择吸附性的树脂将脱色后的混合液中的苯乙酸吸附,经固液分离,分别得到6-APA的水溶液和吸附有苯乙酸的树脂。所述的树脂为AB-8大孔吸附树脂。
[0035] 将6-APA的水溶液转移至结晶器中,结晶器内温度控制在15~20℃,向结晶器内加氨水,逐渐调节结晶器内溶液pH值至6-APA的等电点(PI=4.3),得到6-APA的结晶,过滤、洗涤、干燥后得到6-APA。相关结果数据见表1。
[0036] 青霉素酰化酶激活剂结构式如下:
[0037]
[0038] 实施例2:6-APA的制备
[0039] 将浓度为100000U/mL的青霉素发酵液1000mL放置在温度控制在26~30℃的搅拌反应器中,搅拌。待发酵液的温度达到26~30℃时,加入青霉素酰化酶60g(酶活120U/g)和青霉素酰化酶激活剂5mg,进行裂解,并在裂解过程中不断滴加浓度为10%的氨水,将反应器中pH值维持在7.0~7.6,当停止加入氨水后20min内反应器中pH值保持不变时,反应结束。
[0040] 将裂解反应后的混合液依次经过10微米的过滤器、1微米的过滤器除去固体的青霉素菌丝。然后再将混合溶液依次经过截留分子量为30000~50000道尔顿的超滤器和截留分子量为3000~5000道尔顿的超滤器,除去大分子蛋白质等杂质。
[0041] 将除杂后的混合溶液经过截留分子量为100~260道尔顿的纳滤器,使混合溶液得到浓缩,浓缩至6-APA的质量浓度为5%。
[0042] 利用活性炭、三氧化二铝等将浓缩液脱色,得到脱色后的混合液。
[0043] 利用特定选择吸附性的树脂将脱色后的混合液中的苯乙酸吸附,经固液分离,分别得到6-APA的水溶液和吸附有苯乙酸的树脂。所述的树脂为AB-8大孔吸附树脂。
[0044] 将6-APA的水溶液转移至结晶器中,结晶器内温度控制在10~15℃,向结晶器内加氨水,逐渐调节结晶器内溶液pH值至6-APA的等电点(PI=4.3),得到6-APA的结晶,过滤、洗涤、干燥后得到6-APA。相关结果数据见表1。
[0045] 实施例3:6-APA的制备
[0046] 将浓度为100000U/mL的青霉素发酵液1000mL放置在温度控制在34~38℃的搅拌反应器中,搅拌。待发酵液的温度达到34~38℃时,加入青霉素酰化酶60g(酶活120U/g)和青霉素酰化酶激活剂5mg,进行裂解,并在裂解过程中不断滴加浓度为10%的氨水,将反应器中pH值维持在7.6~8.5,当停止加入氨水后20min内反应器中pH值保持不变时,反应结束。
[0047] 将裂解反应后的混合液依次经过10微米的过滤器、1微米的过滤器除去固体的青霉素菌丝。然后再将混合溶液依次经过截留分子量为30000~50000道尔顿的超滤器和截留分子量为3000~5000道尔顿的超滤器,除去大分子蛋白质等杂质。
[0048] 将除杂后的混合溶液经过截留分子量为100~260道尔顿的纳滤器,使混合溶液得到浓缩,浓缩至6-APA的质量浓度为15%。
[0049] 利用活性炭、三氧化二铝等将浓缩液脱色,得到脱色后的混合液。
[0050] 利用特定选择吸附性的树脂将脱色后的混合液中的苯乙酸吸附,经固液分离,分别得到6-APA的水溶液和吸附有苯乙酸的树脂。所述的树脂为AB-8大孔吸附树脂。
[0051] 将6-APA的水溶液转移至结晶器中,结晶器内温度控制在20~25℃,向结晶器内加氨水,逐渐调节结晶器内溶液pH值至6-APA的等电点(PI=4.3),得到6-APA的结晶,过滤、洗涤、干燥后得到6-APA。相关结果数据见表1。
[0052] 实施例4:6-APA的制备,与实施例1对比,不添加青霉素酰化酶激活剂
[0053] 将浓度为100000U/mL的青霉素发酵液1000mL放置在温度控制在30~34℃的搅拌反应 器中,搅拌。待发酵液的温度达到30~34℃时,加入青霉素酰化酶60g(酶活120U/g),进行裂解,并在裂解过程中不断滴加浓度为10%的氨水,将反应器中pH值维持在7.6左右,当停止加入氨水后20min内反应器中pH值保持不变时,反应结束。
[0054] 将裂解反应后的混合液依次经过10微米的过滤器、1微米的过滤器除去固体的青霉素菌丝。然后再将混合溶液依次经过截留分子量为30000~50000道尔顿的超滤器和截留分子量为3000~5000道尔顿的超滤器,除去大分子蛋白质等杂质。
[0055] 将除杂后的混合溶液经过截留分子量为100~260道尔顿的纳滤器,使混合溶液得到浓缩,浓缩至6-APA的质量浓度为10%。
[0056] 利用活性炭、三氧化二铝等将浓缩液脱色,得到脱色后的混合液。
[0057] 利用特定选择吸附性的树脂将脱色后的混合液中的苯乙酸吸附,经固液分离,分别得到6-APA的水溶液和吸附有苯乙酸的树脂。所述的树脂为AB-8大孔吸附树脂。
[0058] 将6-APA的水溶液转移至结晶器中,结晶器内温度控制在15~20℃,向结晶器内加氨水,逐渐调节结晶器内溶液pH值至6-APA的等电点(PI=4.3),得到6-APA的结晶,过滤、洗涤、干燥后得到6-APA。相关结果数据见表1。
[0059] 表1 各实施例制备的6-APA的纯度、收率及裂解时间
[0060] 6-APA纯度 6-APA收率 裂解时间(min)
实施例1 99.6% 99.6% 36
实施例2 99.4% 98.3% 41
实施例3 99.5% 98.2% 45
实施例4 99.2% 90.1% 129
[0061] 从表1中实施例1和实施例4的对比可以看出,添加青霉素酰化酶激活剂后不仅可以提高6-APA的收率,还可以显著缩短裂解时间,生产效率是不添加青霉素酰化酶激活剂的3倍多,说明本发明提供的青霉素酰化酶激活剂可以显著提高青霉素酰化酶的转化活力,与现有技术相比具有突出的实质性特点和显著的进步。
[0062] 实施例5:青霉素酰化酶激活剂的制备和结构确证
[0063] 试剂来源:乙醇、石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、二氯甲烷为分析纯,购自上海凌峰化学试剂有限公司,甲醇,分析纯,购自江苏汉邦化学试剂有限公司。
[0064] 制备方法:(a)将佛手的干燥成熟果实(10kg)粉碎,用70%乙醇热回流提取(25L×3次),合并提取液,浓缩至无醇味(3L),依次用石油醚(3L×3次)、乙酸乙酯(3L×3次) 和水饱和的正丁醇(3L×3次)萃取,分别得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物(431g)和正丁醇萃取物;(b)步骤(a)中乙酸乙酯萃取物用AB-8型大孔树脂除杂,先用10%乙醇洗脱8个柱体积,再用75%乙醇洗脱10个柱体积,收集75%乙醇洗脱液,减压浓缩得75%乙醇洗脱物浸膏(157g);(c)步骤(b)中75%乙醇洗脱浸膏用正相硅胶分离,依次用体积比为75:1(8个柱体积)、45:1(8个柱体积)、20:1(8个柱体积)、12:1(8个柱体积)和1:1(5个柱体积)的二氯甲烷-甲醇梯度洗脱得到5个组分;(d)步骤(c)中组分4(49g)用正相硅胶进一步分离,依次用体积比为20:1(8个柱体积)、12:1(10个柱体积)和5:1(8个柱体积)的二氯甲烷-甲醇梯度洗脱得到3个组分;(e)步骤(d)中组分2(25g)用十八烷基硅烷键合的反相硅胶分离,用体积百分浓度为75%的甲醇水溶液等度洗脱,收集10-12个柱体积洗脱液,洗脱液减压浓缩得到纯的化合物(Ⅰ)(565mg)。
[0065] 结构确证:黄色粉末;HR-ESI-MS显示[M+H]+为m/z 395.1932,结合核磁特征可得分子式为C23H26N2O4,不饱和度为12。核磁共振氢谱数据δH(ppm,DMSO-d6,500MHz):H-3(4.13,d,J=4.9Hz),H-5a(3.12,dd,J=11.2,6.2Hz),H-5b(2.74,dd,J=11.2,4.0Hz),H-6(6.02,dd,J=6.2,4.0Hz),H-10(6.84,d,J=8.7Hz),H-11(7.32,t,J=8.7Hz),H-12(7.13,d,J=8.7Hz),H-14a(2.23,m),H-14b(1.92,dd,J=12.2,3.5Hz),H-15(3.13,dt,J=12.2,
4.2Hz),H-17(7.40,m),H-18a(4.84,d,J=17.2Hz),H-18b(4.81,d,J=8.7Hz),H-19(5.42,ddd,J=17.5,10.0,8.5Hz),H-20(2.71,m),H-21a(2.32,overlap),H-21b(2.16,t,J=
11.0Hz),9-OMe(3.81,s),17-OMe(3.84,s),22-OMe(3.62,s);核磁共振碳谱数据δC(ppm,DMSO-d6,125MHz):164.2(C,2-C),50.2(CH,3-C),47.2(CH2,5-C),124.3(CH,6-C),130.7(C,
7-C),113.2(C,8-C),159.3(C,9-C),112.9(CH,10-C),130.2(CH,11-C),117.8(CH,12-C),
148.3(C,13-C),26.6(CH2,14-C),32.2(CH,15-C),110.3(C,16-C),160.9(CH,17-C),113.1(CH2,18-C),140.2(CH,19-C),42.3(CH,20-C),56.5(CH2,21-C),168.1(C,22-C),55.8(9-OMe),61.3(17-OMe),50.8(22-OMe)。UV谱图中的最大吸收带222nm、347nm与394nm表明含有吲哚片段。氢谱核磁数据表明该结构中存在一组ABX偶合特征的质子信号δH6.84(1H,d,J=
8.7Hz,H-10),7.32(t,J=8.7Hz,H-11)与7.13(d,J=8.7Hz,H-12)。此外,氢谱与碳谱核磁数据表明化合物结构中含有一个β-甲氧基丙烯酸甲酯基片段,一个乙烯基片段,一个甲氧基苯片段,这些信息提示该化合物可能是9-甲氧基-Corynanthe类单萜生物碱。通过HMBC谱分析可知,乙烯基片段中的H-19与C-20和C-21的相关性表明乙烯基片段连接在C-20位上。
在Corynanthe类单萜生物碱的生物合成途径中H-15总是处在α位,据ROESY谱分析,H-15 与H-14b、H-19和H-21a存在相关信号,而H-20与H-14a和H-21b有相关信号,说明H-20与H-14a为β构型。此外,ROESY谱中H-3与H-20以及H-3与H-14a的相关信号归属了H-3为β构型。综合氢谱、碳谱、HMBC谱和ROESY谱,以及文献关于相关类型核磁数据,可基本确定该化合物如下式所示,立体构型进一步通过ECD试验确定,理论值与实验值基本一致。
[0066] 该化合物的化学结构和碳原子编号如下:
[0067]
[0068] 上述实施例的作用在于说明本发明的实质性内容,但并不以此限定本发明的保护范围。本领域的普通技术人员应当理解,可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换,而不脱离本发明技术方案的实质和保护范围。