[0021] 除非另有定义,本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的,不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
[0022] 除非特别说明,本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。除非特别说明,以下实施例所用试剂和材料均为市购。
[0023] 实施例1:肺腺癌中H2AFX和CBX3的检测
[0024] 从广东某医院获得8对新鲜肺腺癌组织和相应癌旁组织。这项研究符合《赫尔辛基宣言》的规定,通过审查委员会批准。所有研究参与者均获得书面知情同意书。
[0025] 对肺腺癌组织和相应癌旁组织,使用Trizol试剂提取总的RNA,采用ReverTra Ace qPCR RT试剂盒进行反转录,采用SYBR Green Realtime PCR Master Mix和RTFQ‑PCR仪(罗氏LightCycler 480)进行相对定量分析。反应条件:95℃1min,95℃15s,60℃30s,循环40-△△CT次,数据结果采用2 法进行分析。引物序列如表1所示。结果显示(图1),H2AFX和CBX3在癌组织中高表达。
[0026] 表1引物序列
[0027] 基因名称 引物序列H2AFX F 5’‑gaggctttggtgggagagac‑3’;R 5’‑agttcagaagccaacggagg‑3’CBX3 F 5’‑gccgcgaacgtaatagctct‑3’;R 5’‑gcaccaagtctgcctcatct‑3’β‑actin F 5’‑tcctccctggagaagagcta‑3’;R 5’‑gtacttgcgctcaggaggag‑3’[0028] 实施例2:单克隆抗体的制备
[0029] 将H2AFX蛋白(UniProtKB‑P16104)和CBX3蛋白(UniProtKB‑Q13185)的氨基酸序列进行并对,结果如图2所示,两条蛋白有部分序列有一定的同源性。选择两条多肽作为后续制备单克隆抗体的免疫原,具体多肽为:
[0030] H2AFX多肽:SGRGKTGGKARA;CBX3多肽AGKEKDGTKRKS。
[0031] 选择人工合成的方式合成两条多肽,将两条多肽按照1:1的质量比混合后与佐剂(一般为弗氏佐剂)乳化制备疫苗(0.5mg/ml),免疫小鼠,采用常规的杂交瘤细胞技术分别制备单克隆抗体(参见中国发明专利2022100242306实施例2和实施例3)。经过制备和检测,共筛选了1株较好的杂交瘤细胞和单克隆抗体,所述的单克隆抗体的重链可变区和轻链可变区的序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。
[0032] 常规ELISA方法简述为:分别使用合成的两条多肽(与BSA偶联,偶联步骤为常规的蛋白与多肽偶联方法)分别包被酶标板(1μg/ml),每孔0.1ml,4度包被过夜;洗涤后,使用5%脱脂奶封闭,每孔0.3ml,37℃2h;洗涤后,加入10倍系列稀释的单克隆抗体(均调整浓度为1mg/ml后稀释),每孔0.1ml,37℃1h;洗涤后每孔加入HRP标记羊抗鼠IgG二抗(5000倍稀释);37℃0.5h;洗涤后,加入显色液,每孔0.1ml,37℃10min;加入终止液(2M硫酸),每孔
0.1ml,检测OD450nm值;当P/N值(样品OD值/空白对照OD值)>2.1时判为阳性。按此方法检
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测筛选的单克隆抗体的效价,结果显示,该单克隆抗体与H2AFX多肽的效价为1:10 ,与CBX3
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多肽的效价为1:10。虽然该单克隆抗体与H2AFX蛋白和CBX3蛋白的结合效率不是最高的,但是该单克隆抗体能同时结合H2AFX蛋白和CBX3蛋白,因此,在后续药物的开发中有较好的优势(减少单克隆抗体的使用)。
[0033] 实施例3:肺腺癌的治疗研究
[0034] 3.1siRNA的设计、合成以及验证
[0035] 根据前期的研究,我们设计针对H2AFX和CBX3的抑制剂,以用于肺腺癌的治疗。我们首先设计并合成了H2AFX和CBX3的siRNA,以从基因水平上抑制H2AFX和CBX3的转录和表达,所述的H2AFX和CBX3的siRNA的序列如表2所示。
[0036] 表2 H2AFX和CBX3的siRNA的序列
[0037] 名称 siRNA序列si‑H2AFX F 5’‑aaauuaguccaucuaaaacuc‑3’;R 5’‑guuuuagauggacuaauuuua‑3’si‑CBX3 F 5’‑uuauugcagacuugaagagcu‑3’;R 5’‑cucuucaagucugcaauaaaa‑3’[0038] 我们将设计合成的siRNA分别通过lipo2000转入A549细胞中(分为si‑H2AFX组、si‑CBX3组、si‑H2AFX+si‑CBX3组和对照组),转染4~6h后更换新鲜培养基,在培养箱中培养48~72h。提取细胞RNA,使用实施例1的方法检测siRNA的抑制效率。同时使用CCK8分析(将各组细胞胰酶消化后计数,接种1000个细胞至96孔板,将培养板置37℃、5%CO2培养箱中培养0、24、48和72h,每孔加入10μl CCK‑8溶液后在细胞培养箱内继续温育0.5h,用酶标仪在450nm测定D值)对肺腺癌细胞的抑制作用。RT‑qPCR检测结果显示(图3),si‑H2AFX对H2AFX有良好的抑制作用,si‑CBX3对CBX3有良好的抑制作用,但是不能交叉抑制。CCK8分析结果显示(图4),相较于对照组,其他3组均有良好的抑制作用,且si‑H2AFX+si‑CBX3组较si‑H2AFX组和si‑CBX3组的抑制效果更好,说明联合2个靶点治疗具有比单个靶点的效果更好。
[0039] 3.2单克隆抗体的偶联
[0040] 接下来,我们在实施例2制备的单克隆抗体的基础上,连接上肿瘤细胞的小分子抑制剂,以靶向H2AFX和CBX3,起到抑制肿瘤细胞生长的作用,从而起到靶向治疗肺腺癌的目的。我们从众多的抗癌药物中选择博来霉素作为抑制H2AFX和CBX3的抑制剂,将博来霉素偶联到单克隆抗体Fc端,具体偶联方法简述为:用SPDP(3‑(2‑吡啶二巯基)丙酸N‑羟基琥珀酰亚胺酯)为连接剂,单克隆抗体与SPDP的克分子比为1:12,博来霉素与SPDP的克分子比为1:1,将巯基化的抗体与巯基化的博来霉素混合后加入DTT(二硫苏糖醇),通过SephadexG 25柱层析收集偶联物部分,用BCA方法检测蛋白含量,并保存于‑70℃以下备用。利用紫外‑可见分光光度法和质谱法检测偶联物,通过测定,偶联物中抗体与博来霉素的摩尔比为1:3~
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[0041] 3.3小鼠模型的建立与治疗
[0042] 收集培养的A549细胞,用胰酶消化后,用PBS分别配制成1×107/ml浓度的单细胞悬液,在无菌条件下皮下注射接种于裸小鼠背侧近右腋窝处,每只0.2ml。在皮下接种A549细胞的第7天,挑取肿瘤直径≥5mm的鼠30只,按照完全随机化分组的方法将小鼠分为6组(具体分组、用药和最终结果见表3所示),用药24d后,处死小鼠,计算抑瘤率,其中单抗和单抗+博来霉素偶联的为腹腔注射给药,si‑H2AFX+si‑CBX3为尾静脉注射给药。结果显示(表3),组5(联合用药)取得的治疗效果最好(比单独用药的抑瘤率更高),且单抗与博来霉素偶联组(组3)的效果要比单独的单抗(组2)的效果要好。
[0043] 表3小鼠分组、用药及其结果比较
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[0045] 上述实施例为本发明较佳的实施方式,但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制,其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化,均应为等效的置换方式,都包含在本发明的保护范围之内。