[0076] 以下通过实施例来示例性说明本申请的实施方案,对于本领域的普通技术人员而言,在本申请的教导下,根据现有技术,对本申请实施方案进行的改进,仍属于本申请的保护范围内。
[0077] 实施例中使用的化合物原料的来源是:1,5-环辛二烯二氯化铂购买于Sigma公司,其它试剂和原料为国产分析纯或化学纯试剂。
[0078] 实施例中使用的人乳腺癌(MCF-7、MDA-MB-231)、结肠癌(HCT-116)细胞来自首都师范大学DNA损伤应答北京市重点实验室。
[0079] 熔点用XT5B或X-4型精密显微熔点仪(控温型)测定(北京福凯仪器有限公司),温度未校正。核磁共振氢谱、碳谱(1H,13C NMR)用Varian NMR system 600MHz超导核磁共振谱仪测定,TMS为内标。紫外-可见光谱用Perkin Elmer Lambda 750紫外可见分光光度计测定。荧光用SpectraMax M5多功能微板读板仪(Molecular Devices,USA)测定。电喷雾高分辨质谱(ESI-HRMS)用Thermo Scientific LTQ Orbitrap Discovery质谱仪测定。
[0080] 本申请的配合物的晶体X-射线衍射数据是在室温293K环境下,利用Bruker SMART APEXII CCD单晶衍射分析仪,在45KV、35mA的工作条件下收集的。两数据包通过专业SMART和SAINT软件还原,及SADABS软件的经验吸收矫正后,采用直接法进行结构解析,利用SHELXTL软件包的全矩阵最小二乘法精修,并对所有非氢原子做各向异性修正。最终的晶体学数据及所涉及的精修参数列于表1和表2。
[0081] 主要抗体
[0082]
[0083] 实施例1
[0084] 配合物14的配体I′a和配合物15的配体I′b的合成
[0085] 参照本课题组已建立的实验方法(中国专利ZL201410459107.2),合成配体I′a、I′b,并进行了结构表征,数据如下:
[0086] (Z)-N′-(5-氟-1-(2-吗啉乙基)-2-氧代吲哚-3-亚基)肼基二硫代甲酸甲酯(配体I′a)
[0087] 产率:52%,黄色固体,mp 183-185℃.1H NMR(600MHz,CDCl3)δ:2.52(br s,4H,morpholine-H),2.63(t,J=6.6Hz,2H,morpholine-CH2),2.68(s,3H,SCH3),3.66(t,J=4.2Hz,4H,morpholine-H),3.87(t,J=6.6Hz,2H,indolin-2-one-CH2),6.85(dd,J=9.0,
3.0Hz,1H,indolin-2-one 7-H),7.10(td,J=9.0,3.0Hz,1H,indolin-2-one 6-H),7.42(dd,J=7.2,3.0Hz,1H,indolin-2-one 4-H),13.80(s,1H,NH).13C NMR(150MHz,CDCl3)δ:
17.73,37.33,53.66(2C),55.34,66.85(2C),108.93(d,J=25.7Hz),110.13(d,J=8.0Hz),
117.78(d,J=24.3Hz),120.92(d,J=8.9Hz),132.07,139.31(d,J=1.4Hz),159.39(d,J=
241.2Hz),160.76,202.47.UV-Vis[DMSOλmax,nm]:251,397.ESI-HRMS m/z:C16H20FN4O2S2([M+
+H])计算值:383.1012;实测值:383.1007。
[0088] (Z)-N′-(5-甲氧基-1-(2-吗啉乙基)-2-氧代吲哚-3-亚基)肼基二硫代甲酸甲酯(配体I′b)
[0089] 产率:34%,黄色固体,mp 147-149℃.1H NMR(600MHz,CDCl3)δ:2.56(br s,4H,morpholine-H),2.65(br s,2H,morpholine-CH2),2.68(s,3H,SCH3),3.70(br s,4H,morpholine-H),3.84(s,3H,OCH3),3.88(br s,2H,indolin-2-one-CH2),6.85(br s,1H,indolin-2-one 7-H),6.94(dd,J=8.4,2.4Hz,1H,indolin-2-one 6-H),7.24(d,J=2.4Hz,1H,indolin-2-one 4-H),13.86(s,1H,NH).13C NMR(150MHz,CDCl3)δ:17.66,37.22,
53.66(2C),55.37,55.95,66.87(2C),106.76,110.10,117.63,120.38,133.23,137.16,
156.33,160.78,202.17.UV-Vis[DMSOλmax,nm]:250,398.ESI-HRMS m/z:C17H23N4O3S2([M+H]+)计算值:395.1212;实测值:395.1206。
[0090] 配合物14、15的合成
[0091] 将化合物I′a或I′b(1.0mmol)溶于热的无水乙醇(20mL)中,分批加入1,5-环辛二烯二氯化铂(0.19g,0.5mmol),加热回流反应4小时。趁热过滤,滤液旋转蒸发除去溶剂,残余物用乙醇重结晶得配合物14或15。将其分别溶于二氧六环/甲醇(4:1,v/v)的混合液中,室温下缓慢挥发溶剂,得到用于X-射线衍射分析的单晶。配合物14、15的晶体学参数、键长和键角数据见表1和表2。
[0092] 1)配合物14
[0093] 收率:64%,棕色固体,mp>300℃.1H NMR(600MHz,DMSO-d6)δ:2.84(s,6H,2SCH3),2.97(m,8H,morpholine-H),3.10(m,4H,morpholine-CH2),3.58(m,8H,morpholine-H),
3.88(m,4H,indolin-2-one-CH2),7.31(br s,2H,indolin-2-one 4-H),7.55(td,J=8.4,
2.4Hz,2H,indolin-2-one 6-H),7.42(dd,J=8.4,2.4Hz,2H,indolin-2-one 7-H).13C NMR(150MHz,DMSO-d6)δ:18.89(2C),40.36(2C),51.58(4C),56.38(2C),63.62(4C),111.61(d,J=7.6Hz,2C),116.40(d,J=27.3Hz,2C),119.96(d,J=9.8Hz,2C),121.61(d,J=19.8Hz,
2C),139.73(2C),149.49(d,J=3.2Hz,2C),158.44(d,J=237.75Hz,2C),162.33(2C),
192.15(2C).UV-Vis[DMSOλmax,nm]:266,395,508.ESI-HRMS m/z:C32H37F2N8O4S4Pt([M+H]+)计算值:958.1436;实测值:958.1431。
[0094] 2)配合物15
[0095] 产率:77%,棕色固体,mp>300℃.1H NMR(600MHz,DMSO-d6)δ:2.86(s,6H,2SCH3),2.91(m,8H,morpholine-H),3.01(m,4H,morpholine-CH2),3.63(m,8H,morpholine-H),
3.82(s,6H,2OCH3),3.90(m,4H,indolin-2-one-CH2),7.22(d,J=8.4Hz,2H,indolin-2-one
7-H),7.25(dd,J=8.4,2.4Hz,2H,indolin-2-one 6-H),7.94(d,J=2.4Hz,2H,indolin-2-
13
one 4-H). C NMR(150MHz,DMSO-d6)δ:19.07(2C),40.40(2C),51.52(4C),52.40(2C),
56.19(2C),63.56(4C),111.23(2C),114.72(2C),119.93(2C),121.38(2C),137.40(2C),
150.32(2C),155.81(2C),162.25(2C),190.83(2C).UV-Vis[DMSOλmax,nm]:274,392,
509.ESI-HRMS m/z:C34H43N8O6S4Pt([M+H]+)计算值:982.1836;实测值:982.1831。
[0096] 表1.配合物14和15的晶体学数据及精修参数
[0097]
[0098] a R1=Σ||Fo|–|Fc||/Σ|Fo|.bwR2={Σ[w(Fo2–Fc2)2]/Σ[w(Fo2)2]}1/2.[0099] 表2.配合物14和15的键长和键角数据
[0100]
[0101] 实施例2
[0102] 本申请的吲哚啉-2-酮的肼基二硫代甲酸甲酯衍生物的铂配合物的抗肿瘤活性评价
[0103] 配合物14、15的抗增殖活性
[0104] 采用MTS比色法,测试了配合物14、15及其相应配体I′a、I′b对人结肠癌HCT-116和人乳腺癌MCF-7、MDA-MB-231细胞株的抗增殖活性,实验结果见表3。
[0105] 由表3可看出,铂配合物14、15、配体I′a、I′b对所测的三种细胞系均表现出一定的抗增殖活性。与配体I′a、I′b相比,配合物14、15具有更强的活性,尤其配合物14的活性是相应配体I′a的的8倍,表明与Pt(II)配位导致抗增殖活性显著增强。此外,配合物14、15对测试的三种肿瘤细胞的抗肿瘤活性明显优于临床抗癌药物顺铂(cDDP)。
[0106] 表3.化合物I′a、I′b和14、15对HCT-116、MCF-7和MDA-MB-231细胞的抗增殖活性[0107]
[0108] 配合物14、15和配体I′a、I′b对细胞周期的影响
[0109] 顺铂(cis-diaminedichloroplatinum(II),cDDP)在恶性肿瘤治疗中具有良好的疗效,它主要通过作用于含氮碱基与DNA双链形成链内交联进而诱导细胞凋亡。考虑到HCT-116和MCF-7比MDA-MB-231细胞系对测试化合物更敏感,但MCF-7细胞黏连生长不易吹打成单个细胞,因此,本申请的发明人选用了HCT-116细胞,采用流式细胞术考察了配合物14、15及其配体I′a、I′b对HCT-116细胞周期进程的影响。在IC50的浓度下处理HCT-116细胞24h,与阳性对照顺铂类似,经配合物14、15处理之后也观察了到明显的sub-G1峰,而配体的sub-G1信号非常弱。与另一阳性对照Taxol处理得到的结果类似,经配体I′a、I′b处理24h的HCT-
116细胞,其G2/M期的比例有所增加。上述实验结果提示,配合物14、15能够诱导HCT-116细胞发生凋亡,而且与配体对细胞的作用机制有所不同。
[0110] 配合物15和配体I′b对细胞凋亡的影响
[0111] 为了进一步验证本申请的配合物是否具有诱导肿瘤细胞凋亡的作用,本申请的发明人采用蛋白质印迹法(Western blot)分析了不同浓度的配合物15处理HCT-116细胞不同时间后,观察多聚(ADP-核糖)聚合酶[poly(ADP-ribose)polymerase 1,PARP1]的裂解。发现,HCT-116细胞经配合物15处理后,PARP1裂解片段随着时间的延长、浓度的增加而明显增加,处理10h后裂解的PARP1印迹非常明显。因此,又选择处理HCT-116细胞10h,同时观察配合物和配体对细胞PARP1的裂解情况。发现经配体I′b处理后HCT-116细胞中PARP1蛋白几乎不受影响。PARP1的裂解片段是细胞凋亡的重要标志。因此,实验结果表明,本申请的配合物15能够引起细胞的凋亡,而配体I′b似乎并不能诱导细胞凋亡。
[0112] 配合物14导致细胞凋亡形态变化
[0113] 为了能够更加直观的看到细胞凋亡的整个过程,采用活细胞荧光成像技术,通过向活细胞中转入能够表达荧光蛋白的基因,让其在细胞中表达,即可通过荧光显微系统观察到特定的亚细胞结构形态变化。让带荧光标记的微管蛋白(α-tubulin)和组蛋白(H2A)在MCF-7细胞中表达,能够直观的看到微管(红色)和细胞核(绿色)不同时间的变化。从实验结果得知,在IC50的浓度下,经配合物14处理后,随着时间的推移,细胞核出现皱缩,染色质最后凝聚在一起,表明配合物14能诱导细胞凋亡。
[0114] 配合物14、15和配体I′a、I′b与DNA的相互作用
[0115] 溴化乙啶(ethidium bromide,EB)常作为探针用于检测DNA的结构,被广泛应用于小分子与DNA的作用研究和抗肿瘤药物的筛选。EB在溶液中的荧光强度较弱,但当它专一性的嵌入DNA的碱基对之间后荧光强度大大增加。当DNA分子的结构发生改变时,结合到碱基对之间的EB又会游离出来,发生荧光淬灭。当药物分子与DNA发生作用时,通过体系中检测荧光强度的变化即可辨别药物与DNA是否发生作用。
[0116] 为了探讨配合物是否与顺铂一样通过作用于DNA而诱导细胞凋亡,通过EB探针分子竞争性结合来评价配合物14、15及其配体I′a、I′b与DNA结合能力。结果表明增加配合物的浓度,荧光强度明显降低,荧光淬灭,表示配合物的确能够竞争性结合DNA。
[0117] 配合物的抗肿瘤活性评价中所涉及到的生物学实验
[0118] 常用试剂的配制、细胞培养、细胞增殖抑制试验(MTS assay)、蛋白质印迹实验(Western blot)方法,参见现有技术的文献(Ding,P.P.;Gao,M.;Mao,B.B.;Cao,S.L.;Liu,C.H.;Yang,C.R.;Li,Z.F.;Liao,J.;Zhao,H.;Li,Z.;Li,J.;Wang,H.;Xu X.Synthesis and biological evaluation of quinazolin-4(3H)-one derivatives bearing dithiocarbamate side chain at C2-position as potential antitumor
agents.Eur.J.Med.Chem.2016,108,364-373)。
[0119] 细胞周期(Cell cycle profiles)
[0120] ⑴流式分析前的细胞处理与固定:将细胞按合适浓度接种于六孔盘中,待细胞贴壁后给药,根据不同需要及化合物的性质处理不同时间。
[0121] ⑵加药处理完毕后,将细胞收集于离心管中离心(4℃,1000g,离心1min,翻转EP管再离心一次),弃上清液,加1mL PBS吹打重悬细胞,按上述方法离心弃上清液。
[0122] ⑶固定细胞:加300μL置于冷浴中的PBS重悬细胞,再加等量无水乙醇充分混匀,冰浴片刻。重复加入300μL乙醇两次,使乙醇的终浓度为75%。冰浴30min后置于4℃层析柜保存,可保存两周。
[0123] ⑷将固定好的细胞在4℃,1000g,离心2min,弃上清液,凉置样品,使乙醇尽可能的挥干。
[0124] ⑸用1mL 0.1%PBST洗两次,用l×的PBS缓冲液稀释RNase A(10mg/mL,l:100)和PI(2mg/mL,1:200),每个样品加400μL RNase A和PI染色剂染色;
[0125] ⑹37℃水浴30min,每隔10分钟摇动样品管,使沉淀的细胞悬浮,使其与PI充分接触。
[0126] ⑺流式检测样品,测样前注意避光保存。上样前用500目的筛过滤到EP管中,过滤时顶住筛一次性吹出去。
[0127] 细胞转染实验
[0128] ⑴将待检测的细胞系按合适的浓度(根据转染试剂说明说计数)接种在6孔盘中,培养过夜。
[0129] ⑵准备混合液:37℃预热三无培养基(无血清和抗生素),然后取三无培养基97μL,转染试剂FuGENE6 3μL混合均匀,室温静置10min。
[0130] ⑶将带有荧光蛋白基因的质粒(1μg)加入另一EP管中,10min后,将准备好的混合液加入已放入质粒的新EP管中,混合均匀,室温静置15min。
[0131] ⑷除去6孔盘细胞中的旧培养基,用PBS润洗细胞一遍,加入新鲜的完全培养基(2mL每孔)。15min后,将静置好的混合液加入到相应的6孔盘,充分摇匀。
[0132] ⑸将转染后的细胞置于37℃、CO2培养箱中培养,24-48h后,荧光显微镜观察下观察荧光蛋白表达并拍照。