[0017] 以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。
[0018] 以下具体实施例用来进一步说明本发明,但本发明绝非限于这些例子。下述实施例中所用的实验材料如无特殊说明均为市购产品,实验步骤如无特殊说明均为标准步骤。
[0019] 实施例一:放线菌素X2在纺织面料染色上的应用。
[0020] 本实施例的放线菌素X2通过以下方法制备:
[0021] 1)将采自温州南麂岛的鞘丝藻Lyngbya sp.样品,剪成1cm×1cm的方块,加少许水‑2 ‑3用研钵充分研磨,利用10倍稀释法将研磨液稀释为10 、10 的液体,涂布在pH=7.4–7.6的加盐培养基上,28℃恒温培养6–7天,挑选出外泌黄色色素的菌株,得到链霉菌,命名为A102,用20%甘油将菌株保存于‑80℃,待用,其中加盐培养基的配方为:20g可溶性淀粉,1g KNO3,0.5g K2HPO4,0.5g MgSO4·7H2O,0.5g NaCl,0.01g FeSO4·7H2O,20g琼脂,25g海盐,
1L蒸馏水;
[0022] 形态观察:在高氏一号平板成白色斑点状,外圈有菌丝。培养3–4天后向外分泌黄色色素,6–7天后整个平板完全变为黄色。在光学显微镜下观察,菌体呈现放射状菌丝。
[0023] 16S rRNA测序:测序结果与GenBank数据库比对,并对序列进行系统发育树的构建,确定菌株为蓝微褐链霉菌Streptomyces cyaneofuscatus。
[0024] 链霉菌S.cyaneofuscatus A102,已于2019年8月2日保藏于中国微生物菌种保藏管理中心,保藏编号为CGMCC No.18358。
[0025] 2)将步骤1)得到的链霉菌纯化后接种到上述相同配方的加盐培养基上,在28℃培养箱中培养5天。
[0026] 切取上述高氏一号平板表面的菌种适量,接种至已灭菌的、盛有pH=7.0–7.4的加盐ISP4培养基的三角瓶中,28℃恒温下,以摇床转速160rpm震荡培养7天后采用乙酸乙酯灭活,待用;
[0027] ;加盐ISP4培养基为10g/L可溶性淀粉,1g/L MgSO4·7H2O,2g/L(NH4)2SO4,1mg/L FeSO4·7H2O,1g/L K2HPO4,1g/L NaCl,2g/L CaCO3,1mg/L MnCl2·7H2O,1mg/L ZnSO4·7H2O,24.4g/L海盐;
[0028] 将上述链霉菌A102经加盐ISP4培养基发酵培养的发酵液用离心机以转速5000rpm,25℃离心15min;取上层清液,以发酵液:乙酸乙酯=1:1的比例进行萃取,收集乙酸乙酯层;用旋转蒸发仪浓缩蒸干,用甲醇重溶,过0.22μm的滤膜;进一步利用HPLC分离纯化:采用C18柱(YMC‑Pack ODS‑A,250×20mm),以30–70%的乙腈/水为流动相进行梯度洗脱,流速为8mL/min,收集保留时间tR=15min的峰(检测波长443nm),得到放线菌素X2,产量达
98.2mg/L,化学结构式为:
[0029]
[0030] ,其中数字表示碳原子的标位。
[0031] 对产物进行鉴定,结果如下:
[0032] 1)性状:无定形桔红色粉末
[0033] 2)溶解性:难溶于水,可溶于乙醇,易溶于甲醇、乙酸乙酯等有机试剂[0034] 3)紫外光谱:产物全波长光谱如图3所示,在443nm处有最大吸收峰。
[0035] 4)核磁谱图信号归属:产物13C信号归属与文献(Frontiers in Microbiology(2017)DOI 10.3389/fmicb.2017.01147,Identification,Bioactivity,and Productivity of Actinomycins from the Marine‑Derived Streptomyces heliomycini,Dongyang Wang,Cong Wang et al.)报道的放线菌素X2核磁数据完全一致,比较结果见表1。
[0036] 表1.所制备的产物13C NMR数据δC(ppm,in CDCl3)与文献比较
[0037]
[0038] 放线菌素X2的染色实验:
[0039] 1)实验材料:本实施例制备所得放线菌素X2、棉、涤纶、锦纶、真丝、皂片、碳酸钠、硫酸钠、剪刀等;
[0040] 2)染色方法:1%o.w.f,水浴比1:30,温度为80℃,40g/L硫酸钠,8g/L碳酸钠,具体为:
[0041] a)裁剪40mm×100mm的棉、涤纶、锦纶和真丝各一块,称重后根据配方称量各试剂量,并配好染浴;
[0042] b)织物用水润湿后挤干,分别投入到对应染浴中,置于80℃的恒温水浴锅中染色,不断搅拌,防止染色不匀;
[0043] c)上染5min后,向染浴中加入硫酸钠,并不断搅拌,染色30min;
[0044] d)向染浴中加入碳酸钠进行固色,不断搅拌;
[0045] e)40min后,固色完成,取出试样,充分水洗,晾干。
[0046] 3)实验结果
[0047] 染色结果如图4所示,从图中可以看出,该色素对真丝布料染色效果最佳,对真丝布料进行进一步染色效果评价,结果显示干摩擦牢度4–5级,湿摩擦牢度4级,皂洗牢度为4级。
[0048] 实验结果证明本发明所涉及的放线菌素X2具有很好的真丝染色效果,可用于染整工业。
[0049] 染色真丝的抗菌活性实验
[0050] 1)实验材料:染色真丝布料、未染色真丝、营养肉汤(牛肉膏3g/L;蛋白胨5g/L;蒸馏水1L;pH=6.8±0.2)、肉汤琼脂培养基(牛肉膏3g/L;蛋白胨5g/L;琼脂粉15g/L;蒸馏水1L;pH=6.8±0.2)、0.03mol PBS缓冲液(磷酸氢二钠2.84g/L;磷酸二氢钾1.36g/L;蒸馏水
1L;pH=7.2–7.4)
[0051] 2)实验方法:
[0052] a)吸取2mL活化的金黄色葡萄球菌菌液,移入装有9mL营养肉汤的试管中,充分混匀。吸取1mL移入另一支装有9mL营养肉汤的试管中,充分混匀。吸取1mL移入装有9mL×0.03mol/L PBS缓冲液的试管中,充分混匀。吸取5mL移入装有45mL×0.03mol/L PBS缓冲液的三角烧瓶中。
[0053] b)准备9支装有PBS缓冲液的试管,其中3支加入未染色真丝对照样,3支加入染色真丝试样,另3支不加试样作为空白对照。
[0054] c)“0”接触时间制样:用吸管往3个对照组试管和3个空白组试管中各加入5mL接种菌液。盖好瓶塞,放在24℃恒温振荡器上,以130–160r/min,振荡1min,然后进行下一步“0”接触时间取样。
[0055] d)“0”接触时间取样:用移液枪从“0”接触时间制样的6支试管中各吸取1mL溶液,移入装有9mL×0.03mol/L PBS缓冲液的试管中,充分混匀。用10倍稀释法再进行1次稀释,‑2充分混匀。吸取1mL移入灭菌的平皿,倾注肉汤琼脂培养基约15mL。分别吸取每个10 稀释倍数的试管制作两个平板作平行样。室温凝固,倒置平板,37℃培养24h记录每个平板中的菌落数。
[0056] e)定时振荡接触:向3个抗菌织物试样试管中各加入5mL接种菌液。已完成“0”接触时间取样且塞好塞子的另6个试管不再加入接种液。再将此9个试样的试管置于24℃恒温振荡器上,以150r/min,振荡24h。
[0057] f)24h后,从每个试管中吸取1mL试液,移入装有9mL×0.03mol/L PBS缓冲液的试管中,充分混匀。用10倍稀释法系列稀释至合适稀释倍数。用移液枪从每个稀释倍数的试管中分别吸取1mL加入灭菌的培养皿,倾注肉汤琼脂培养基约15mL。每个处理做两个平行。室温凝固,倒置平板,37℃培养24h。选择菌落数在30CFU–300CFU之间的合适稀释倍数的平板进行计数。若最小稀释倍数平板中的菌落数<30,则按实际数量记录;若无菌落生长,则菌落数记为“<1”。
[0058] 3)实验结果及分析
[0059] “0”接触取样计数结果如表2所示:
[0060] 表2“0”接触取样计数(稀释倍数10‑2)
[0061]
[0062] 定时取样计数结果如表3所示:
[0063] 表3定时取样计数
[0064]
[0065] a)活菌浓度的计算
[0066] 根据两个平板得到的菌落数,按式(1)计算每个试样试管内的活菌浓度(保留两位有效数字)。
[0067] K=Z×R (1)
[0068] K:每个试样烧瓶内的活菌浓度(CFU/mL);
[0069] Z:两个平板菌落数的平均值;
[0070] R:稀释倍数。
[0071] b)试验有效性的判断
[0072] 根据式(2)计算试验菌的增长值F。对金黄色葡萄球菌,当F大于或等于1.5;且对照烧瓶中的活菌浓度比接种时的活菌浓度增加时,试验判定为有效。否则试验无效,需重新进行试验。
[0073] F=lgWt‑1gW0 (2)
[0074] F:对照样的试验菌增长值;
[0075] Wt:3个对照样18h振荡接触后试管内的活菌浓度的平均值(CFU/mL));
[0076] W0:3个对照样“0”时接触后试管内的活菌浓度的平均值(CFU/mL);
[0077] Wt=(38+33+52+45)/4×104=395000CFU/mL(记录平板菌落数在30‑300之间的平板)
[0078] W0=(3+1)/2×102=200CFU/mL
[0079] F=lg395000‑lg200=3.30≥1.5(表明试验有效)
[0080] c)抑菌率的汁算
[0081] 振荡接触18h后,比较对照组与实验组试管内的活菌浓度,按式(3)计算抑菌率(保留2位有效数字)。
[0082] Y=(Wt‑Qt)/Wt×100% (3)
[0083] Y:式祥的抑菌率;
[0084] Wt:3个对照样18h振荡接触后试管内的活菌浓度的平均值(CFU/mL);
[0085] Qt:3个实验样18h振荡接触后试管内的活菌浓度的平均值(CFU/mL)。
[0086] Y=(395000‑2000)/395000×100%=99.49%≥70%(表明染色真丝对金黄色葡萄球菌有抗菌效果)。抗菌实验的直观效果如图5所示。
[0087] 实施例二:放线菌素D在真丝面料染色上的应用。
[0088] 放线菌素D的化学结构式为:
[0089]
[0090] ,实验的操作步骤与实施例一相同。
[0091] 染色结果如图6所示,对真丝布料进行色效果评价结果,皂洗牢度达到4级。