发明内容
[0008] 本发明的目的是提供一种用于快速检测溶液中氨基甲酸乙酯含量的分光光度方法，要解决的技术问题是构建检测氨基甲酸乙酯所需要的双酶偶联体系。该体系中氨基甲酸乙酯降解酶将氨基甲酸乙酯水解生成乙醇、水和氨，在谷氨酸脱氢酶催化下氨与共底物α-酮戊二酸反应生成谷氨酸，同时伴随着还原型辅酶烟酰胺腺嘌呤二核苷酸NADH被氧化。从而该体系将氨基甲酸乙酯含量转化成NADH含量的变化，利用NADH在340 nm处吸光值的变化，实现对液态体系中氨基甲酸乙酯含量的检测，原理图如图1所示。
[0009] 本发明的技术方案，一种快速检测氨基甲酸乙酯含量的分光光度方法，步骤为：
[0010] （1）构建双酶偶联催化体系
[0011] a、酶源：氨基甲酸乙酯降解酶，对氨基甲酸乙酯EC降解酶产生菌菌株CGMCC NO.5763细胞培养后经超声破碎、离心、浓缩、凝胶层析、超滤浓缩后所得；谷氨酸脱氢酶则为市售商品酶；
[0012] b、酶液以及其他溶液的制备：用25mmol·L-1 PBS缓冲液溶解氨基甲酸乙酯降解酶以及谷氨酸脱氢酶，使得二者酶活分别为16U·mL-1和10U·mL-1；配制540mmol·L-1α-酮戊二酸溶液；7.5mmol·L-1NADH以及不同浓度的氨基甲酸乙酯标准溶液；
[0013] c、双酶偶联体系的构建：向反应体系中分别加入20μL上述氨基甲酸乙酯降解酶和谷氨酸脱氢酶溶解液，66μL的α-酮戊二酸溶液，20μL NADH溶液，20μL 1mmol·L-1氨基甲酸乙酯溶液和454μL PBS缓冲液，使得总反应体系体积为600μL，置于石英比色皿中混合均匀；然后将此反应体系置于分光光度计中用动力学方法监测溶液中NADH在340nm处吸光值的变化情况；
[0014] （2）双酶偶联体系对氨基甲酸乙酯含量的快速测定：
[0015] d、用纯度大于99%的氨基甲酸乙酯配制浓度为0.001、0.005、0.01、0.05、0.1、0.5和1 mmol·L-1的母液；
[0016] e、向双酶偶联体系中加入适当体积和浓度的氨基甲酸乙酯母液使得反应体系中氨基甲酸乙酯浓度分别为0、0.1、0.2、0.5、1、2、5、10、20、30、40、50 μmol·L-1；将所得的溶液体系混合均匀后置于分光光度计中用动力学方法监测NADH在340 nm处吸光值的变化，反应时间为5min；将EC的浓度与340nm处吸光值在5min内的变化制作得到标准曲线，如图2所示；
[0017] f、向模拟黄酒样品（通过向pH 6.0，25 mmol·L-1PBS缓冲液中添加无水乙醇制备模拟黄酒，酒精度为15%）中添加一定量的氨基甲酸乙酯母液，在双酶偶联反应体系中反应5 min后检测NADH在340nm处的吸光值变化，通过对比标准曲线计算模拟酒样中氨基甲酸乙酯含量。
[0018] 建立的方法能够快速检测并准确定量溶液样品中的氨基甲酸乙酯含量。在模拟黄酒样品中的检测限为0.1 μmol·L-1，线性相关系数为0.995，样品回收率为95.54%-100.01%，相对标准差为1.634%-4.611%（表1）。
[0019] 表1检测模拟黄酒样品中氨基甲酸乙酯的回收率以及相对标准差
[0020]
[0021] 本发明的有益效果：本发明通过对双酶偶联体系中最适缓冲体系、氨基甲酸乙酯降解酶和谷氨酸脱氢酶最适添加量、α-酮戊二酸最适反应浓度等多个实验条件进行优化，建立了快速实时检测氨基甲酸乙酯含量的分光光度方法。该方法具有灵敏、快速、简捷、无需昂贵的仪器和复杂繁琐的操作工序等优点，克服了以往方法中的诸多不足。
