发明内容
[0007] 本发明的目的在于提供一种易操作,效果好的抗暗纹东方鲀源致病性维氏气单胞菌卵黄抗体的制备方法。
[0008] 本发明的技术解决方案是:
[0009] 一种抗暗纹东方鲀源致病性维氏气单胞菌卵黄抗体的制备方法,其特征是:包括下列步骤:
[0010] (1)将保藏编号为CCTCC No:M2012154的暗纹东方鲀源致病性维氏气单胞菌(Aeromonas veronii)SY-R2(保藏单位:中国典型培养物保藏中心,保藏单位地址:中国武汉大学,保藏日期:2012年5月3日,分类命名:Aeromonas veronii SY-R2)划线接种大豆酪蛋白琼脂培养基平板,37℃培养24 h,挑取单菌落涂布于直径15 cm的TSA平板,于37 ℃10
培养20 h;用无菌PBS洗下菌苔,测定并调整菌液浓度为2.5 ×10 CFU/ mL ;纯检合格后按0.5%(V/V)福尔马林液37 ℃灭活24 h,无菌检验合格后供制备抗原;每5重量份灭活菌液加入灭菌的氢氧化铝胶1重量份,加入相当于灭活菌液和氢氧化铝胶总重量0.01%的硫柳汞防腐,得到菌苗;
[0011] (2)免疫程序:28周龄罗曼蛋鸡进行翅静脉采血作为对照血清,开产后收集鸡蛋作为实验对照;开产后第3天,用步骤(1)制备的菌苗胸肌多点注射免疫,剂量0.5mL/只;首次免疫后1周进行第二次免疫,免疫剂量 1.0mL/只;第二次免疫后每隔20d加强免疫,连续免疫2次,免疫剂量均为1.0mL/只;第四次免疫后40d,再进行免疫,免疫剂量为2.0mL/只;从首次免疫开始,每次免疫后7天翅静脉采血分离血清,并收集所有鸡蛋,对免疫后每间隔7d 收集的鸡蛋进行效价测定;用微量凝集法初步测定免疫鸡血清和卵黄中抗体的有无;
[0012] (3)卵黄液的预处理:收集第四次免疫后鸡蛋,用清水刷拭干净后浸于0.5%新洁尔灭中消毒、凉干,于无菌条件下分离出卵黄,加入1.5倍体积的生理盐水,高速匀浆制备乳浊液;
[0013] (4)卵黄粉的制备:将经步骤(3)预处理的卵黄液进行喷雾干燥,制得卵黄粉,其中IgY即抗暗纹东方鲀源致病性维氏气单胞菌卵黄抗体。
[0014] 步骤(2)对免疫后每间隔7d 收集的鸡蛋,无菌条件下分离出卵黄,80 g/L聚乙二醇-8 000(PEG-8 000)一步法提纯卵黄抗体,ELISA测定抗体效价,第四次免疫后ELISA测定的卵黄抗体效价为1:12560。
[0015] 步骤(4)中喷雾干燥的进风温度为120℃-140℃,出风温度为68℃-72℃。
[0016] 步骤(3)中高速匀浆转速为9500r/min,时间为10-20 min。
[0017] 保藏编号为CCTCC No:M2012154的暗纹东方鲀源致病性维氏气单胞菌(Aeromonas veronii)SY-R2通过下列步骤的选育方法得到:取具有典型症状、死亡后一小时内的暗纹东方鲀的心脏、肝脏病灶进行细菌分离培养,所用培养基为大豆酪蛋白琼脂培养基平板,30℃培养24h,选取优势菌在TSA平板上进行纯培养直至菌落纯,获得致病菌株;所述典型症状为:腹部膨大,肛门红肿,体表及胸鳍、腹鳍和臀鳍残缺、基部充血、出血、解剖时有大量淡黄色带血的水样腹水;肝脏肿大,呈土黄色,有大小不一的出血斑块;胆囊膨大;肠道无食,充满泡沫状粘液,肠粘膜出血。
[0018] 本发明易操作,效果好,第四次免疫后ELISA测定的卵黄抗体效价为1:12560。,进一步制成的卵黄抗体粉效价不变。与其他技术相比本发明的独特之处还在于:首先,抗原来自于暗纹东方鲀,维氏气单胞菌引起的暗纹东方鲀疾病在国内外从未见过报道,是暗纹东方鲀一种全新的疾病。第二,以维氏气单胞菌为抗原制备的卵黄抗体在国内外同样未见过报道。第三,该发明中所述的卵黄抗体液的预处理使卵黄抗体形成乳浊液,这在卵黄抗体粉的制备过程中未见过报道。
[0019] 下面结合实施例对本发明作进一步说明。
[0020] 暗纹东方鲀源致病性维氏气单胞菌,保藏编号为CCTCC No:M2012154;分类命名:灵芝,拉丁文学名:Aeromonas veronii SY-R2,保藏单位:中国典型培养物保藏中心,保藏单位地址:中国武汉大学,保藏日期:2012年5月3日。