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一种磁性固相萃取检测果蔬中植物生长调节剂的方法 0 0

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申请进展

基本信息

申请人信息

代理人信息

摘要

法律状态

权利要求

说明书

专利申请流程有哪些步骤？

申请

申请号：指国家知识产权局受理一件专利申请时给予该专利申请的一个标示号码。唯一性原则。

申请日：提出专利申请之日。

2019-05-07

申请公布

申请公布指发明专利申请经初步审查合格后，自申请日（或优先权日）起18个月期满时的公布或根据申请人的请求提前进行的公布。

申请公布号：专利申请过程中，在尚未取得专利授权之前，国家专利局《专利公报》公开专利时的编号。

申请公布日：申请公开的日期，即在专利公报上予以公开的日期。

2019-09-10

授权

授权指对发明专利申请经实质审查没有发现驳回理由，授予发明专利权；或对实用新型或外观设计专利申请经初步审查没有发现驳回理由，授予实用新型专利权或外观设计专利权。

2022-02-01

预估到期

发明专利权的期限为二十年，实用新型专利权期限为十年，外观设计专利权期限为十五年，均自申请日起计算。专利届满后法律终止保护。

2039-05-07

基本信息

有效性	有效专利	专利类型	发明专利
申请号	CN201910374049.6	申请日	2019-05-07
公开/公告号	CN110133125B	公开/公告日	2022-02-01
授权日	2022-02-01	预估到期日	2039-05-07
申请年	2019年	公开/公告年	2022年
缴费截止日	2023-06-07
分类号	G01N30/02 、G01N30/06 、G01N30/08 、B01J20/22 、B01J20/30 、B01J20/28 、B01D15/08	主分类号	G01N30/02
是否联合申请	独立申请	文献类型号	B
独权数量	1	从权数量	7
权利要求数量	8	非专利引证数量	0
引用专利数量	0	被引证专利数量	0
非专利引证
引用专利		被引证专利
专利权维持	3	专利申请国编码	CN
专利事件		事务标签	公开、实质审查、授权

申请人信息

申请人	曲阜师范大学	第一申请人	曲阜师范大学
专利权人	曲阜师范大学	当前专利权人	曲阜师范大学
发明人	李国梁、吴頔、吴永宁、李宁	第一发明人	李国梁
地址	山东省济宁市曲阜市静轩西路57号	邮编	273165
申请人数量	1	发明人数量	4
申请人所在省	山东省	申请人所在市	山东省济宁市

代理人信息

代理机构

专利代理机构是经省专利管理局审核，国家知识产权局批准设立，可以接受委托人的委托，在委托权限范围内以委托人的名义办理专利申请或其他专利事务的服务机构。

济南泉城专利商标事务所

代理人

专利代理师是代理他人进行专利申请和办理其他专利事务，取得一定资格的人。

贾波

摘要

本发明公开了一种磁性固相萃取检测果蔬中植物生长调节剂的方法，该方法以磁性共价有机骨架材料Fe3O4@COF(TpDA)作为磁性固相萃取的吸附剂，对果蔬中的植物生长调节剂进行萃取。本发明采用MSPE技术检测果蔬中的PGRs，选择Fe3O4@COF(TpDA)作为吸附剂，该吸附剂使用方便，表面存在许多羰基和芳香环，可以通过疏水相互作用、π‑π相互作用和氢键实现PGRs的富集和萃取，萃取效果好、结构稳定性好、可以重复使用，能够灵敏的检测出果蔬中存在的多种微量PGRs。本发明首次将Fe3O4@COF(TpDA)的MSPE与HPLC‑DAD结合用于测定PGRs，为PGRs的检测提供了新的思路。

摘要附图
说明书附图：图1
说明书附图：图2
说明书附图：图3
说明书附图：图4
说明书附图：图5
说明书附图：图6
说明书附图：图7
说明书附图：图8
说明书附图：图9
说明书附图：图10
说明书附图：图11
说明书附图：图12

法律状态

序号	法律状态公告日	法律状态	法律状态信息
1	2022-02-01	授权
2	2019-09-10	实质审查的生效	IPC(主分类): G01N 30/02 专利申请号: 201910374049.6 申请日: 2019.05.07
3	2019-08-16	公开

权利要求

权利要求书是申请文件最核心的部分，是申请人向国家申请保护他的发明创造及划定保护范围的文件。

1.一种磁性固相萃取检测果蔬中植物生长调节剂的方法，其特征是：以磁性共价有机骨架材料Fe3O4@COF(TpDA)作为磁性固相萃取的吸附剂，对果蔬中的植物生长调节剂进行萃取，所述植物生长调节剂为吲哚‑3‑乙酸、吲哚‑3‑丙酸、吲哚‑3‑丁酸、1‑萘乙酸、2‑萘乙酸、
1‑萘氧乙酸和2‑萘氧乙酸。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征是：所述果蔬为水果和蔬菜。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征是：所述Fe3O4@COF(TpDA)是1,3,5‑三醛基间苯三酚和2,6‑二氨基蒽醌在Fe3O4纳米粒子表面进行席夫碱反应得到的。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征是：所述Fe3O4@COF(TpDA)的制备过程是：将1,3,
5‑三醛基间苯三酚、2,6‑二氨基蒽醌和Fe3O4纳米粒子按照1:1‑2:1‑2的摩尔比分散在二恶烷中，用液氮快速冷冻后抽真空密封，待温度自然升至室温后将混合物置于115‑125℃下反应3‑4天，反应后冷却至室温，收集产物，洗涤、干燥，得Fe3O4@COF(TpDA)。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征是：包括以下步骤：
（1）将果蔬样品切成小块并搅碎，将5 g样品加入5‑8 mL甲醇中超声提取35‑45 min，然后离心取上清液，离心后剩余的样品再按照此方法用甲醇提取3次，合并所得上清液，得萃取液；
（2）将上述萃取液用氮气干燥，除去大部分溶剂后用水稀释至10 mL，即为样品溶液；
（3）向上述10 mL样品溶液中加入12‑18 mg Fe3O4@COF(TpDA)，涡旋使Fe3O4@COF(TpDA)充分吸附样品中的植物生长调节剂，然后收集Fe3O4@COF(TpDA)；
（4）将吸附植物生长调节剂后的Fe3O4@COF(TpDA)加入1‑2 mL 0.5‑2wt%的甲酸的乙腈溶液中，超声处理将植物生长调节剂从Fe3O4@COF(TpDA)中解吸出来，然后过滤收集洗脱液；
（5）将上述洗脱液进行HPLC分析，检测植物生长调节剂的含量。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征是：步骤（3）中，涡旋时间为5min。

7.根据权利要求5所述的方法，其特征是：步骤（4）中，解吸时间为10min。

8.根据权利要求5所述的方法，其特征是：高效液相色谱分析的色谱条件为：
色谱柱：Hypersil GOLD C18柱；
检测器：二极管阵列检测器；
流动相A：5wt%的乙腈水溶液，流动相B：纯乙腈；
梯度洗脱：0‑2min，流动相B 体积分数由30%增至34%；2‑13min，流动相B体积分数保持
34%不变；13‑15min，流动相B体积分数由34%增至100%；
流速：1 mL/min；
柱温：25 ºC；
进样量：10 μL；
检测波长：280 nm。

说明书

技术领域

[0001] 本发明涉及一种检测果蔬中植物生长调节剂的方法，具体涉及一种采用磁性固相萃取法检测果蔬中植物生长调节剂的方法。

背景技术

[0002] 植物生长调节剂(PGRs)是一类包括人工合成的具有天然植物激素相似作用的化合物和从生物中提取的天然植物激素，广泛应用于加速植物的生长，提高农作物的产量等。但是，过量使用PGRs给人类带来一些潜在的威胁，如早熟、生殖器官受损、致癌、急性毒性和神经毒性等。人类主要是通过水果和蔬菜接触植物生长调节剂，目前，如何有效地检测在植物中处于微量浓度水平的PGRs仍然是分析化学领域的一个挑战，因此开发有效、灵敏PGRs测定方法是非常必要的。

[0003] 植物中PGRs的浓度处于微量水平(0.1‑50μg/kg，鲜重)，因此，前处理在样品分析中起着至关重要的作用，特别是对于复杂的样品基质。磁性固相萃取(MSPE)是一种新型的固相萃取技术，将萃取和浓缩一起完成，因其操作方便、易分离、省时的特点而受到极大关注。在MSPE过程中，吸附剂对于实现高效和优异的萃取性能是重要的。目前，有一些具有磁芯和功能壳复合结构的磁性材料已被用作萃取PGRs的吸附剂，功能壳的结构为吸附提供更多的活性位点并且可以保护磁芯。例如，Fe3O4@P(MA‑L‑Phe‑OMe)纳米颗粒已经成功被合成并应用于富集豆芽中的2,4‑二氯苯氧乙酸(2,4‑D)和4‑氯苯氧乙酸(4‑CPA)。Chen课题组成功制备了具有抗氧化、超顺磁性、高表面积和高超分子识别等特点的Fe3O4@SiO2/GO/β‑CD，并将其用作9种PGRs的MSPE吸附剂。但是，目前报道的磁芯和功能壳复合结构的磁性材料具有吸附剂用量大、萃取时间长、灵敏度不高等不足，随着对检测灵敏度需求的不断增加，合成一种合适的化合物作为MSPE吸附剂仍然具有一定的挑战性。

发明内容

[0004] 本发明的目的是提供一种磁性固相萃取(MSPE)检测果蔬中植物生长调节剂(PGRs)的方法，本方法采用MSPE对果蔬中的PGRs进行富集和萃取，选择磁性共价有机骨架材料Fe3O4@COF(TpDA)作为吸附剂，具有萃取效果好、可重复使用、灵敏度高、耗时短和操作方便等优点。

[0005] 共价有机骨架材料(COFs)是一种新型的结晶多孔聚合物，由有机结构单元通过共价键构建而成。由于其具有低密度、大比表面积、高稳定性和永久孔隙率的特点而引起了人们的浓厚兴趣，这些特性使它们可以应用于分离科学领域。本发明通过使用Fe3O4纳米粒子作为磁芯、使用COF(TpDA)作为外壳，得到了具有核‑壳结构的磁性COFs(Fe3O4@COF(TpDA))，并将Fe3O4@COF(TpDA)用作萃取水果和蔬菜中PGRs的吸附剂，使用高效液相色谱法(HPLC)来检测所提取的PGRs。由于Fe3O4@COF(TpDA)具有芳香环和大量羰基，可以通过π‑π和氢键作用来富集PGRs，且COF(TpDA)稳定性好、不易破坏、可以重复使用。

[0006] 本发明具体技术方案如下：

[0007] 一种磁性固相萃取(MSPE)检测果蔬中植物生长调节剂(PGRs)的方法，该方法以磁性共价有机骨架材料Fe3O4@COF(TpDA)作为磁性固相萃取的吸附剂，对果蔬中的植物生长调节剂进行萃取。Fe3O4@COF(TpDA)作为磁性固相萃取技术的吸附剂，对果蔬中的PGRs进行吸附，然后采用HPLC进行检测，能够提高PGRs的检测灵敏度。

[0008] 进一步的，上述方法中，所述果蔬为水果和蔬菜。

[0009] 进一步的，上述方法中，所述PGRs为吲哚‑3‑乙酸(IAA)、吲哚‑3‑丙酸(IPA)、吲哚‑3‑丁酸(IBA)、1‑萘乙酸(1‑NAA)、2‑萘乙酸(2‑NAA)、1‑萘氧乙酸(1‑NOA)或2‑萘氧乙酸(2‑NOA)。

[0010] 进一步的，上述方法中，所述Fe3O4@COF(TpDA)是1,3,5‑三醛基间苯三酚(Tp)和2,6‑二氨基蒽醌(DA)在Fe3O4纳米粒子表面进行席夫碱反应得到的。经试验验证，该Fe3O4@COF(TpDA)吸附剂对于上述PGRs的萃取富集效果更佳，能够更灵敏的检测出果蔬中的PGRs。
Fe3O4@COF(TpDA)的具体制备过程是：将1,3,5‑三醛基间苯三酚、2,6‑二氨基蒽醌和Fe3O4纳米粒子按照1:1‑2:1‑2的摩尔比分散在二恶烷中，用液氮快速冷冻后抽真空密封，待温度自然升至室温后将混合物置于115‑125℃下反应3‑4天，反应后冷却至室温，收集产物，洗涤、干燥，得Fe3O4@COF(TpDA)。

[0011] 进一步的，本发明的检测方法包括以下具体步骤：

[0012] (1)将果蔬样品切成小块并搅碎，将5g样品加入5‑8mL甲醇中超声提取35‑45min，然后离心取上清液，离心后剩余的样品再按照此方法用甲醇提取3次，合并所得上清液，得萃取液；

[0013] (2)将上述萃取液用氮气干燥，除去大部分溶剂后用水稀释至10mL，即为样品溶液；

[0014] (3)向上述10mL样品溶液中加入12‑18mg Fe3O4@COF(TpDA)，涡旋使Fe3O4@COF(TpDA)充分吸附样品中的PGRs，然后收集Fe3O4@COF(TpDA)；

[0015] (4)将吸附PGRs后的Fe3O4@COF(TpDA)加入1‑2mL 0.5‑2wt％的甲酸的乙腈溶液中，超声处理将PGRs从Fe3O4@COF(TpDA)中解吸出来，然后过滤收集洗脱液；

[0016] (5)将上述洗脱液进行HPLC分析，检测PGRs的含量。

[0017] 进一步的，步骤(2)中，干燥是为了将溶剂除去，但是由于分析物在水中的溶解性不好，所以干燥时仅除去大部分溶剂，不会将溶剂全部除去，而是留下少量的溶剂以保证分析物在样品溶液中是完全溶解的。

[0018] 进一步的，步骤(3)中，涡旋时间为5min，步骤(4)中，解吸时间为10min。

[0019] 进一步的，本发明采用HPLC分析PGRs的成分和含量，色谱条件为：

[0020] 色谱柱：Hypersil GOLD C18柱；

[0021] 检测器：二极管阵列检测器(DAD)；

[0022] 流动相A：5％的乙腈水溶液，流动相B：纯乙腈；

[0023] 梯度洗脱：0‑2min，流动相B的体积分数由30％增至34％；2‑13min，流动相B的体积分数保持34％不变；13‑15min，流动相B的体积分数由34％增至100％；

[0024] 流速：1mL/min；

[0025] 柱温：25℃；

[0026] 进样量：10μL；

[0027] 检测波长：280nm。

[0028] 本发明采用MSPE技术检测果蔬中的PGRs，选择具有磁性的核壳结构Fe3O4@COF(TpDA)作为吸附剂，该吸附剂使用方便，表面存在许多羰基和芳香环，可以通过疏水相互作用、π‑π相互作用和氢键实现PGRs的富集和萃取，萃取效果好、结构稳定性好、可以重复使用，能够灵敏的检测出果蔬中存在的多种微量PGRs。本发明首次将Fe3O4@COF(TpDA)的MSPE与HPLC‑DAD结合用于测定PGRs，为PGRs的检测提供了新的思路。

实施方案

[0041] 下面通过具体实施例对本发明进行进一步说明，下述说明仅是示例性的，并不对其内容进行限定。

[0042] 下述实施例中，如无特别说明，各浓度均为质量百分浓度。

[0043] 下述实施例中，所用1,3,5‑三醛基间苯三酚(Tp)、2,6‑二氨基蒽醌(DA)、吲哚‑3‑乙酸(IAA)、吲哚‑3‑丙酸(IPA)、吲哚‑3‑丁酸(IBA)、1‑萘乙酸(1‑NAA)、2‑萘乙酸(2‑NAA)、1‑萘氧乙酸(1‑NOA)和2‑萘氧乙酸(2‑NOA)购自美国Sigma公司。其他试剂如无特别说明，均为市购产品。

[0044] 实施例1

[0045] 制备Fe3O4@COF(TpDA)吸附剂，步骤如下：

[0046] 1、Fe3O4纳米粒子的制备

[0047] 将1.35g FeCl3·6H2O，3.85g NH4OAC和0.40g柠檬酸钠分散于70mL乙二醇中，并在室温下通过磁力搅拌混合1h以产生均匀溶液。将所得溶液转移到100mL反应釜中，然后加热至200℃保持16h。待冷却至室温后，用外部磁铁收集产物，并用乙醇和水洗涤数次，直至上清液澄清。最后，将产物在60℃下真空干燥，得Fe3O4纳米粒子。

[0048] 2、Fe3O4@COF(TpDA)的制备

[0049] 将63.0mg Tp，107.2mg DA和80mg Fe3O4纳米粒子分散在3mL二恶烷中。将混合物转移到一耐压管中，然后将耐压管在液氮浴中快速冷冻，将耐压管抽空至19mbar并火焰密封，待温度恢复至室温后，将悬浮液置于120℃的烘箱中保持3d。待冷却至室温后，用外部磁铁收集产物，用DMF和THF洗涤数次，直至上清液澄清。然后将产物在80℃下干燥，即为Fe3O4@COF(TpDA)。

[0050] 图1为所得Fe3O4纳米粒子和Fe3O4@COF(TpDA)的透射电镜(TEM)图，从图中可以看出，Fe3O4纳米粒子为球形，表面光滑，而Fe3O4@COF(TpDA)表面粗糙，这表明在Fe3O4纳米粒子的表面上形成了COF(TpDA)壳，并且COF(TpDA)壳的厚度约为75nm。

[0051] 图2为所得Fe3O4纳米粒子和Fe3O4@COF(TpDA)的X射线衍射(XRD)谱图，从图中可以看出，在30.1°，35.3°，42.9°，53.2°，57.1°和62.6°的衍射峰分别与(220)，(311)，(400)，(402)，(511)和(440)晶面对应，表明制备的Fe3O4纳米粒子具有良好的结晶度。与Fe3O4纳米粒子的XRD谱图相比，Fe3O4@COF(TpDA)在3.1°处的衍射峰可能归因于低结晶度的COF(TpDA)壳。

[0052] 图3为所得Fe3O4纳米粒子和Fe3O4@COF(TpDA)的傅立叶红外光谱(FT‑IR)图，从图‑1 ‑1 ‑1中可以看出，在596cm 处的强吸收带是Fe‑O‑Fe振动的特征，而在3449cm 和1575cm 处的吸收带主要是由表面吸附的水和羟基产生的。和Fe3O4纳米粒子的FT‑IR谱图对比，发现‑1
Fe3O4@COF(TpDA)在1263cm 处显示出新的吸收带，是由C‑N产生的，验证了COF(TpDA)壳的形成。

[0053] 图4为所得Fe3O4@COF(TpDA)的N2吸附‑解吸等温线，该等温线证实了Fe3O4@COF2
(TpDA)的多孔结构，其为中孔结构。经检测，Fe3O4@COF(TpDA)的BET比表面积为180.2m/g，
3
孔体积为0.31cm /g，平均孔径为3.5nm。Fe3O4@COF(TpDA)材料的大比表面积使其成为提取PGRs的理想吸附剂。

[0054] 图5为所得Fe3O4纳米粒子和Fe3O4@COF(TpDA)的磁滞曲线。Fe3O4@COF(TpDA)的饱和磁化强度值为62.3emu/g，表明其具有超顺磁特性。尽管Fe3O4@COF(TpDA)的饱和磁化强度值低于Fe3O4纳米粒子的饱和磁化强度值，但这种高饱和磁性已经足以使Fe3O4@COF(TpDA)对外部磁体产生快速响应。如图5插图所示，Fe3O4@COF(TpDA)可以很好地分散在水中以形成棕色悬浮液，并在外部磁体的帮助下非常快速地收集，收集仅需要30s，使用方便。

[0055] 实施例2

[0056] 以实施例1制备的Fe3O4@COF(TpDA)为吸附剂，对检测PGRs的工艺条件进行筛选，步骤如下：

[0057] 1、标准溶液配制

[0058] 分别称取10mg的IAA、IPA、IBA、1‑NAA、2‑NAA、1‑NOA和2‑NOA，将它们分别溶解在10mL的乙腈中，配成浓度为1mg/mL的PGRs标准溶液，放在4℃的冰箱中避光储存，备用。

[0059] 2、色谱条件

[0060] 在配备二极管阵列检测器的Agilent 1260型高效液相色谱仪(安捷伦公司)上进行色谱分析。在Hypersil GOLD C18柱(150×4.6mm，3μm)上进行PGRs的分离。选择5％的乙腈水溶液(A)和纯乙腈(B)作为流动相。洗脱采用梯度洗脱，程序为(体积分数)：从30％B开始，在2min内增加至34％B，保持11min。然后，在2min内增加至100％B。流速设定为1mL/min，柱温设定为25℃。检测波长设定为280nm，注入体积为10μL。在测试下一个样品之前，将色谱柱用初始流动相平衡5min。

[0061] 3、磁性固相萃取

[0062] 将一定量的Fe3O4@COF(TpDA)分散在10mL PGRs标准溶液中，所得悬浮液在VX‑200漩涡混合器中涡旋一段时间以实现PGRs与吸附剂之间的吸附。然后，通过外部磁铁收集Fe3O4@COF(TpDA)材料并除去上清液。接着，在超声波作用下用洗脱剂将PGRs从Fe3O4@COF(TpDA)材料中解吸出来。最后，收集洗脱液并用0.22μm的尼龙膜过滤，进行HPLC分析。

[0063] 3.1洗脱剂的筛选

[0064] 洗脱剂是决定提取效率的重要因素之一。由于PGRs具有弱酸性，当pH改变时，PGRs将转变为中性或离子形式。因此，选择六种不同的洗脱剂进行研究，分别为(wt％)：含有5％甲酸的乙腈、含有5％甲酸的甲醇、含有5％甲酸的乙醇、乙腈、甲醇和乙醇。如图6所示，当洗脱剂是含有5％甲酸的乙腈时，各PGRs的峰面积最高。此外，进一步优化了洗脱剂中甲酸的含量(图7)。结果表明，选择含1％甲酸的乙腈作为洗脱剂是合适的。

[0065] 3.2吸附剂质量的筛选

[0066] 吸附剂的质量在MSPE步骤中起着至关重要的作用。为了检测吸附剂质量的影响，洗脱剂(1mL含1％甲酸的乙腈)，吸附时间(5min)和解吸时间(10min)是固定的，考察了吸附剂质量在3‑24mg范围内的萃取性能。图8显示PGRs的峰面积随着吸附剂质量的增加而增加，直至其达到15mg，并且此后保持平衡。因此，使用的吸附剂的量选定为15mg。

[0067] 3.3吸附时间的筛选

[0068] 吸附时间也是影响萃取性能的一个因素。所以接下来，通过调节涡旋时间(1‑15min)来探索吸附时间对萃取性能的影响，如图9。结果表明，涡旋5min就足以使吸附剂从
10mL溶液中吸附PGRs。因此，使用5min作为最佳的吸附时间。

[0069] 3.4解吸时间的筛选

[0070] 最后，研究了解吸时间对提取性能的影响，并且从图10中发现，解吸时间对PGRs富集的影响不明显。综合考虑，选择10min作为解吸时间比较合适。

[0071] 经过筛选，优选的磁性固相萃取步骤为：将15mg的Fe3O4@COF(TpDA)分散在10mLPGRs标准溶液中，所得悬浮液在VX‑200漩涡混合器中涡旋5min以实现PGRs与吸附剂之间的吸附。然后，通过外部磁铁收集Fe3O4@COF(TpDA)材料并除去上清液。接着，在超声波作用下用1mL含1％甲酸的乙腈将PGRs从Fe3O4@COF(TpDA)材料中解吸出来，解吸10min。最后，收集洗脱液并用0.22μm的尼龙膜过滤，进行HPLC分析。

[0072] 实施例3

[0073] 上述实施例2筛选得到的优化方法步骤如下：

[0074] 1、标准溶液或样品溶液的配制

[0075] 分别称取10mg的IAA、IPA、IBA、1‑NAA、2‑NAA、1‑NOA和2‑NOA，将它们分别溶解在10mL的乙腈中，配成浓度为1mg/mL的PGRs标准溶液，放在4℃的冰箱中避光储存，备用。

[0076] 将水果或蔬菜样品切成小块并搅碎，称取5g样品和6mL甲醇转移到10mL离心管中，将其超声处理40min，然后将离心管以4000rpm离心10min，收集上清液。使用相同的步骤将样品再提取三次，合并萃取液并用氮气干燥，除去大部分甲醇(因为PGRs在水中的溶解度小，因此要保留少量溶剂以保证分析物完全溶解)。最后，将萃取液用水稀释至10mL，即为样品溶液，备用。

[0077] 2、色谱条件

[0078] 在配备二极管阵列检测器的Agilent 1260型高效液相色谱仪(安捷伦公司)上进行色谱分析。在Hypersil GOLD C18柱(150×4.6mm，3μm)上进行PGRs的分离。选择5％的乙腈水溶液(A)和纯乙腈(B)作为流动相。洗脱采用梯度洗脱，程序为(体积分数)：从30％B开始，在2min内增加至34％B，保持11min。然后，在2min内增加至100％B。流速设定为1mL/min，柱温设定为25℃。检测波长设定为280nm，注入体积为10μL。在测试下一个样品之前，将色谱柱用初始流动相平衡5min。

[0079] 3、磁性固相萃取

[0080] 将15mg的Fe3O4@COF(TpDA)分散在10mLPGRs标准溶液中，所得悬浮液在VX‑200漩涡混合器中涡旋5min以实现PGRs与吸附剂之间的吸附。然后，通过外部磁铁收集Fe3O4@COF(TpDA)材料并除去上清液。接着，在超声波作用下用1mL含1％甲酸的乙腈将PGRs从Fe3O4@COF(TpDA)材料中解吸出来，解吸10min。最后，收集洗脱液并用0.22μm的尼龙膜过滤，进行HPLC分析。

[0081] 对上述优化方法的线性、检测限(LOD)、定量限(LOQ)、准确度和精密度进行评价。使用外标法对PGRs进行定量。PGRs的线性检测范围为50‑2000μg/L。为了获得在该浓度范围内的线性关系，使用上述方法在该范围内选取8个不同浓度的样品进行检测，并且在峰面积与每个浓度之间绘制标准曲线。LOD和LOQ分别根据在3和10的信噪比(S/N)下估算。结果如下表1所示。

[0082] 表1

[0083] 分析物保留时间(min) R LOD(μg/L) LOQ(μg/L)IAA 6.85 0.9998 5.17 17.23
IPA 7.46 0.9999 5.21 17.37
IBA 9.34 0.9999 5.00 16.67
2‑NOA 11.15 0.9990 7.37 24.57
1‑NAA 11.81 0.9999 4.68 15.60
2‑NAA 12.17 0.9999 7.39 24.63
1‑NOA 13.39 0.9995 7.51 25.03

[0084] 将制备的Fe3O4@COF(TpDA)材料应用于水果和蔬菜(包括桔子、苹果、黄瓜和番茄)中微量PGRs的检测，苹果、桔子、番茄和黄瓜是从山东曲阜超市所购买。通过回收率验证上述方法的准确度，将两种浓度(10μg/kg和100μg/kg)的所有分析物加标到实际的水果或蔬菜样品中来计算回收率。根据可重复性评估其精密度，通过对两个浓度水平的加标样品和实际样品检测三次来计算相对标准偏差(RSD)。结果见下表2和3。

[0085] 表2桔子和苹果样品的加标实验结果(n＝3)

[0086]

[0087]

[0088] 表3黄瓜和番茄样品的加标实验结果(n＝3)

[0089]

[0090]

[0091] 从以上数据可以看出，本发明方法显示出令人满意的线性关系，相关系数(R)≥0.9990，并且PGRs的LODs和LOQs分别在4.68‑7.51μg/L和15.60‑25.03μg/L范围内。此外，实际样品中7种PGRs的回收率范围为83.0‑105.0％，RSD在0.7‑4.5％的范围内。本发明方法准确度高、重复性好，可以使用。在上述四种实际样品中，除了在桔子样品中检测到2‑NOA(4.7μg/kg)外，在其他实际样品中均未检测到PGRs的存在。桔子样品经过MSPE之后的色谱图如图11所示，从图中可以看出，各分析物峰形好、分离度好。

[0092] 实施例4

[0093] 为了证实本发明方法的适用性，将本发明与现有技术中的相关检测方法进行了比较(表4和5)，发现本发明方法具有以下几个优点：1、本发明方法需要较少的吸附剂和萃取时间来吸附PGRs；2、本发明方法适用于较多的PGRs分析，并且操作步骤简单。此外，本发明方法的灵敏度和准确度与采用HPLC‑UV检测的工作相当甚至更好。

[0094] 表4不同检测方法比较

[0095]

[0096] 表5不同检测方法比较

[0097]

[0098]

[0099] 参考文献1：Gupta V,Kumar M,Brahmbhatt H,et al.Simultaneous determination of different endogenetic plant growth regulators in common green seaweeds using dispersive liquid‑liquid microextraction method[J].Plant Physiology and Biochemistry,2011,49(11):1259‑1263.

[0100] 参考文献2：Wang L,Wang M,Yan H,et al.A new graphene oxide/polypyrrole foam material with pipette‑tip solid‑phase extraction for determination of three auxins in papaya juice[J].Journal of Chromatography A,2014,1368:37‑43.[0101] 参考文献3：Wang Z H,Xia J F,Han Q,et al.Multi‑walled carbon nanotube as a solid phase extraction adsorbent for analysis of indole‑3‑butyric acid and 1‑naphthylacetic acid in plant samples[J].Chinese Chemical Letters,2013,24(7):588‑592.

[0102] 参考文献4：Zhang Y,Li Y,Hu Y,et al.Preparation of magnetic indole‑3‑acetic acid imprinted polymer beads with 4‑vinylpyridine andβ‑cyclodextrin as binary monomer via microwave heating initiated polymerization and their application to trace analysis of auxins in plant tissues[J].Journal of Chromatography A,2010,1217(47):7337‑7344.

[0103] 参考文献5：Chen J,Cao S,Zhu M,et al.Fabrication of a high selectivity magnetic solid phase extraction adsorbent based onβ‑cyclodextrin and application for recognition of plant growth regulators[J].Journal of Chromatography A,2018,1547:1‑13.

[0104] 参考文献6：Chen J Y,Cao S R,Xi C X,et al.A novel magneticβ‑cyclodextrin modified graphene oxide adsorbent with high recognition
capability for 5plant growth regulators[J].Food Chemistry,2018,239:911‑919.[0105] 对比例1

[0106] Fe3O4@COF(TpBD)的制备：将63.0mg Tp，82mg联苯胺(BD)和80mg Fe3O4纳米粒子分散在3mL二恶烷中。将混合物转移到一耐压管中，然后将耐压管在液氮浴中快速冷冻，将耐压管抽空至19mbar并火焰密封，待温度恢复至室温后，将悬浮液置于120℃的烘箱中保持3d。待冷却至室温后，用外部磁铁收集产物，用DMF和THF洗涤数次，直至上清液澄清。然后将产物在80℃下干燥，即为Fe3O4@COF(TpBD)。

[0107] 1、标准溶液的配制

[0108] 分别称取10mg的IAA、IPA、IBA、1‑NAA、2‑NAA、1‑NOA和2‑NOA，将它们分别溶解在10mL的乙腈中，配成浓度为1mg/mL的PGRs标准溶液，放在4℃的冰箱中避光储存，备用。

[0109] 2、色谱条件

[0110] 同实施例1。

[0111] 3、磁性固相萃取

[0112] 为了体现Fe3O4@COF(TpDA)在检测PGRs中的优点，分别将实施例1的Fe3O4@COF(TpDA)和Fe3O4@COF(TpBD)作为吸附剂在相同的MSPE条件下对PGRs进行吸附，步骤如下：将15mg吸附剂分散在10mL PGRs标准溶液中，所得悬浮液在VX‑200漩涡混合器中涡旋5min以实现PGRs与吸附剂之间的吸附。然后，通过外部磁铁收集吸附剂材料并除去上清液。接着，在超声波作用下用1mL含1％甲酸的乙腈将PGRs从吸附剂材料中解吸出来，解吸10min。最后，收集洗脱液并用0.22μm的尼龙膜过滤，进行HPLC分析，结果如下：

[0113] 表6不同吸附剂比较

[0114]

[0115] 从上表结果可以看出，虽然Fe3O4@COF(TpBD)作为MSPE吸附剂也可以通过π‑π相互作用和疏水作用富集一定量的PGRs，但是吸附量要比Fe3O4@COF(TpDA)作为MSPE吸附剂富集PGRs时少很多。因此，Fe3O4@COF(TpDA)是作为MSPE吸附剂对PGRs进行富集的最佳选择。

[0116] 对比例2

[0117] 1、标准溶液的配制

[0118] 分别称取10mg的IAA、IPA、IBA、1‑NAA、2‑NAA、1‑NOA和2‑NOA，将它们分别溶解在10mL的乙腈中，配成浓度为1mg/mL的PGRs标准溶液，放在4℃的冰箱中避光储存，备用。

[0119] 2、色谱条件

[0120] 在配备二极管阵列检测器的Agilent 1260型高效液相色谱仪(安捷伦公司)上进行色谱分析。在Hypersil GOLD C18柱(150×4.6mm，3μm)上进行PGRs的分离。选择5％的乙腈水溶液(A)和纯乙腈(B)作为流动相。洗脱采用梯度洗脱，程序为(体积分数)：0‑2min，流动相B为30％；2‑10min，流动相B从30％增加到34％；10‑15min，流动相B从34％增加到100％。流速设定为1mL/min，柱温设定为25℃。检测波长设定为280nm，注入体积为10μL。在测试下一个样品之前，将色谱柱用初始流动相平衡5min。

[0121] 3、磁性固相萃取

[0122] 同实施例1。

[0123] 对磁性固相萃取得到的分析物进行HPLC分析，结果如图12所示。从图中可以看出，由于洗脱程序的改变，有一个PGRs无法出峰。

附图说明

[0029] 图1为实施例1制得的Fe3O4纳米粒子和Fe3O4@COF(TpDA)的TEM图，A.Fe3O4纳米粒子，B.Fe3O4@COF(TpDA)。

[0030] 图2为实施例1制得的Fe3O4纳米粒子和Fe3O4@COF(TpDA)的XRD谱图。

[0031] 图3为实施例1制得的Fe3O4纳米粒子和Fe3O4@COF(TpDA)的FT‑IR谱图。

[0032] 图4为实施例1制得的Fe3O4@COF(TpDA)的N2吸附‑解吸等温线。

[0033] 图5为实施例1制得的Fe3O4纳米粒子和Fe3O4@COF(TpDA)的磁滞曲线。

[0034] 图6为不同洗脱剂时各分析物的峰面积。

[0035] 图7为洗脱剂中甲酸不同含量时各分析物的峰面积。

[0036] 图8为不同吸附剂质量时各分析物的峰面积。

[0037] 图9为不同吸附时间时各分析物的峰面积。

[0038] 图10为不同解吸时间时各分析物的峰面积。

[0039] 图11为PGRs的标准色谱图和加标桔子样品经过MSPE之后的色谱图。

[0040] 图12为对比例2所得各PGRs的色谱图。

1一种植物生长调节剂及其制备方法和应用 2一种植物生长调节剂生产用包装机的吹袋装置 3一种磁性固相萃取检测果蔬中植物生长调节剂的方法