[0038] 下面结合附图对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能 够据以实施。
[0039] 应当理解，本文所使用的诸如“具有”、“包含”以及“包括”术语并不排除一个或多个其 它元件或其组合的存在或添加。
[0040] 如图1-图5所示，本发明提供一株具备α-葡萄糖苷酶高抑制活性的植物乳杆菌，所述 菌株的分类命名为：植物乳杆菌Lactobacillus plantarum，该菌株已与2017年8月29日保 藏于中国科学院微生物菌种保藏中心，保藏编号为：CGMCC NO.14573。
[0041] 一种具有α-葡萄糖苷酶高抑制活性的植物乳杆菌的筛选方法，所述植物乳杆菌筛选自 中国农业科学院农产品加工研究所的实验室保藏菌株。
[0042] 依据所述植物乳杆菌具有较高的α-葡萄糖苷酶抑制活性的筛选步骤如下：
[0043] 一、菌种的活化及其菌落总数的测定
[0044] 将冻存于-80℃的77株甘油管乳酸菌接入MRS肉汤培养基中，于37℃恒温培养18h， 活化三代后用于后续试验。将活化好的菌株以4％(v/v)的接种量接入MRS肉汤培养基 中，于37℃静置培养18h，收集菌液，根据GB 4789.2—2010进行菌株菌落总数的测定， 将菌液浓度调节为1×109cfu/mL。
[0045] 二、样品制备
[0046] (1)细胞代谢物(cell-free excretory supernatant CFS)的制备，将活化好的菌株于 MRS培养基中37℃静置培养18h后，在4℃下12000r/min，离心15min收集菌体。将收 集到的菌体用无菌0.1M PBS(pH6.8)洗涤3次，再重悬于PBS中，调节菌液浓度至1×109 cfu/mL，混匀。于37℃孵育12h，在4℃下12000r/min，离心15min，收集上清，以0.22 μm水系微滤膜过滤得到CFS，-80℃保存；
[0047] (2)细胞内容物(cell-free intracellular extract CFE)的制备，将活化好的菌株于MRS 培养基中37℃静置培养18h后，在4℃下12000r/min，离心15min收集菌体。将收集到 的菌体用无菌0.1M PBS(pH6.8)洗涤3次，再重悬于PBS中，调节菌液浓度至1×109cfu/mL， 混匀，进行超声破碎。超声破碎的条件为：在冰浴的条件下，功率200W，以3-5s(工作 3s，停5s)的脉冲破碎12min。将超声后得到的液体于4℃，12000r/min，离心15min， 收集上清，以0.22μm水系微滤膜过滤得到CFE，-80℃保存。
[0048] 三、α-葡萄糖苷酶抑制活性的测定
[0049] 取96孔酶标板，用微量移液器在反应孔中加入25μL 20mM的PNPG及25μL CFS 或CFE，于37℃培养10min，再加入0.01U/mL的α-葡萄糖苷酶50μL，37℃反应15min， 最后加入100μL的0.1M的Na2CO3终止反应，用酶标仪于405nm处测反应液的吸光值。 用阿卡波糖做阳性对照，计算公式(1)如下：α-glucosidase inhibitory rate简写为α-GIR[0050]
[0051] A：含有酶不含样品，样品用0.1M的PBS(pH＝6.8)代替
[0052] B：不含酶不含样品，二者用0.1M的PBS(pH＝6.8)代替
[0053] C：含有酶含有样品
[0054] D：不含酶含有样品，酶用0.1M的PBS(pH＝6.8)代替
[0055] 表1α-葡萄糖苷酶抑制活性的筛选结果
[0056]
[0057] (注：PNPG在α-葡萄糖苷酶的作用下能水解产生葡萄糖和PNP，在405nm处测定 PNP吸光度；表中ND(not detected)表示没有检测到抑制作用。)
[0058] 筛选结果如表1所示，其中的12株乳酸菌的CFS均表现出对α-葡萄糖苷酶的活性有 抑制作用，抑制率可以达到2.530％～15.101％。其中，阳性对照组阿卡波糖的抑制率最高， 为26.75％。且所有乳酸菌的CFE对α-葡萄糖苷酶没有抑制作用。根据表中的抑制率结果， 菌株BLP12对α-葡萄糖苷酶的抑制活性最高。
[0059] 一个优选方案中，所述α-葡萄糖苷酶抑制活性的测定过程，包括测定菌株BLP12对 小鼠肠道α-葡萄糖苷酶活性的抑制率，测定过程如下：
[0060] (1)、小鼠肠道α-葡萄糖苷酶的提取
[0061] 清洁级雄性Balb/c小鼠，禁食12h后断头处死，取小肠上段30cm，用无菌的4℃PBS 冲洗小肠后，剪碎，置于玻璃匀浆器中。加入约4倍体积的PBS在冰浴下进行研磨、匀 浆，倒至离心管。4℃，4000r/min，离心20min，取其上清进行分装。-20℃储存。
[0062] (2)、小鼠肠道α-葡萄糖苷酶活力的测定
[0063] 根据BCA试剂盒的说明书测得小鼠肠道α-葡萄糖苷酶稀释10倍后的蛋白含量为 1.290mg/mL，并通过实验测得小鼠肠道α-葡萄糖苷酶稀释10倍后的酶活力为0.057U/mL。
[0064] (3)、菌株BLP12对小鼠肠道α-葡萄糖苷酶的抑制活性
[0065] 取96孔酶标板，用微量移液器在反应孔中加入25μL 20mM的PNPG及25μL不同 浓度菌株BLP12的CFS，于37℃培养10min，再加入小鼠肠道α-葡萄糖苷酶(0.057U/mL) 50μL，37℃反应15min，最后加入100μL的0.1M的Na2CO3终止反应，用酶标仪于405 nm处测反应液的吸光值。用阿卡波糖做阳性对照，计算公式采用公式(1)
[0066] A：含有酶不含样品，样品用0.1M的PBS(pH＝6.8)代替
[0067] B：不含酶不含样品，二者用0.1M的PBS(pH＝6.8)代替
[0068] C：含有酶含有样品
[0069] D：不含酶含有样品，酶用0.1M的PBS(pH＝6.8)代替
[0070] 表2菌株CFS的浓度对小鼠肠道α-葡萄糖苷酶的抑制率影响
[0071]
[0072] 结果如图1和表2所示，菌液浓度的大小对小鼠肠道α-葡萄糖苷酶的活性具有一定的 影响，菌液浓度越大，其CFS对小鼠肠道α-葡萄糖苷酶的抑制活性越大，当CFS浓度为 110
×10 cfu/mL时，对小鼠肠道α-葡萄糖苷酶活性的抑制率为71.22％，当CFS浓度为 1×
109cfu/mL时，对小鼠肠道α-葡萄糖苷酶活性的抑制率为63.64％，当浓度为1×106cfu/mL 时，对小鼠肠道α-葡萄糖苷酶活性的抑制率仍能达到41.26％。
[0073] (4)检索具有抑制哺乳动物源的α-葡萄糖苷酶活性的菌株的抑制率，与所述植物乳 杆菌BLP12对来源于小鼠肠道的α-葡萄糖苷酶活性的抑制率对比。
[0074] 表3具有抑制哺乳动物α-葡萄糖苷酶活性的菌株汇总
[0075]
[0076] 结果如表3所示，植物乳杆菌BLP12在菌液浓度为1×1010cfu/mL以及菌液浓度为 1×109cfu/mL时的CFS对α-葡萄糖苷酶活性的抑制率均高于其他菌株，由此可见，本发明 所述植物乳杆菌具有α-葡萄糖苷酶高抑制活性。
[0077] 四、16S-rDNA基因测序
[0078] 将筛选得到的菌株按4％(v/v)的接种量接入MRS肉汤培养基中，于37℃培养18h。 取2mL菌液按细菌基因组DNA提取试剂盒提取基因组。用琼脂糖凝胶电泳法和紫外分 光光度法检测分析DNA的纯度及浓度，用细菌16S rDNA扩增通用引物27F和1492R进 行PCR扩增，所述通用引物的碱基序列如表4所示。采用琼脂糖凝胶电泳法对扩增产物 进行检测。最后将扩增出的产物交北京华大基因研究中心完成测序。
[0079] 表4细菌16S rDNA扩增通用引物27F和1492R
[0080]
[0081] (1)扩增反应体系
[0082]
[0083] (2)反应条件
[0084]
[0085] 35个循环，最后72℃延伸10min，将PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳所得结果如 图2所示。(Marker条带组成自下而上分别为：100bp，250bp，500bp，750bp，1000bp， 2000bp，3000bp，5000bp，电泳方向从上向下。)
[0086] Blast结果表明菌株BLP12与Lactobacillus plantarum的亲缘关系最近，属于植物乳杆 菌。
[0087] 一个优选方案中，所述益生指标包括：
[0088] (1)酸耐受性，在pH2.0条件下有较高的存活率；
[0089] (2)胆盐耐受性，在含2％胆盐的去离子水中培养24h后，生长状况良好；
[0090] (3)在人工模拟唾液、胃液和肠液中均可以存活；
[0091] (4)在依次经过人工模拟唾液、胃液以及肠液的一系列消化后仍能很好地存活。
[0092] (5)生长周期短。
[0093] 五、针对以上益生指标对菌株BLP12的益生特性进行下列实验。
[0094] (1)植物乳杆菌BLP12的耐酸性试验
[0095] 将菌株以4％(v/v)的接种量接入MRS肉汤培养基中，于37℃培养18h，在4℃下6000 r/min，离心10min，收集菌体。将收集到的菌体重悬于pH为2.0，3.0，7.0的MRS肉汤 培养基中，调节菌液浓度至1×109cfu/mL。于37℃孵育3h，收集菌液，根据GB4789.2—2010 进行活菌计数。耐受性的计算公式(2)如下：Survival rate(存活率)
[0096] Survival rate(％)＝(log N1/log N0)×100 公式(2)
[0097] N1：经过耐受处理条件下的活菌数
[0098] N0：pH＝6.4(正常)MRS肉汤培养基中的活菌数
[0099] 结果表明，菌株BLP12在pH 3.0的酸性条件下培养3h后，存活率达到了96.93％； 当pH＝2.0时，BLP12存活率为71.04％，也表现出了很高的存活率，说明该菌株对酸性条 件有很好的耐受性。
[0100] (2)植物乳杆菌BLP12对胆盐的耐受性
[0101] 将菌株以4％(v/v)的接种量接入MRS肉汤培养基中，于37℃培养18h，在4℃下6000 r/min，离心10min，收集菌体。将收集到的菌体重悬于pH 8.0、含2％胆盐的无菌去离 子水中，调节菌液浓度至1×109cfu/mL。于37℃孵育24h，收集菌液，根据GB4789.2—2010 进行活菌计数。计算公式同公式(2)。
[0102] 结果表明，菌株BLP12在含2％胆盐的去离子水中培养24h后，生长状况良好，且存 活率很高，为77.14％，对胆盐有很好的耐受性。
[0103] (3)植物乳杆菌BLP12在人工模拟唾液、胃液、肠液中的生长测定
[0104] 参考Versantvoort等的方法配制模拟消化液，充分模拟人体口腔，胃肠道中的消化环 境。
[0105] 将菌株以4％(v/v)的接种量接入MRS肉汤培养基中，于37℃培养18h，在4℃下6000 r/min，离心10min，收集菌体。将收集到的菌体分别重悬于人工模拟的唾液(pH 7.0)、 胃液9
(pH 2.0)、肠液(pH 8.0)中，调节菌液浓度至1×10 cfu/mL。于37℃各环境分别孵 育5min、
3h、24h，收集菌液，根据GB4789.2—2010进行活菌计数。计算公式同公式(2)。
[0106] 结果表明，菌株BLP12在模拟唾液中的生长状况良好。以pH＝7.0的MRS肉汤培养 基中的活菌数为对照时，存活率为94.32％；以pH＝6.4(正常)的MRS肉汤培养基中的活 菌数为对照时，存活率达到了97.22％。
[0107] 在模拟胃液中，菌株BLP12的存活率为52.49％，能达到50％。
[0108] 在模拟肠液中，生长状况良好，存活率达到了94.83％。
[0109] (4)体外模拟消化试验
[0110] 将菌株以4％(v/v)的接种量接入MRS肉汤培养基中，于37℃培养18h，在4℃下6000 r/min，离心10min，收集菌体。将收集到的菌体重悬于pH 7.0的模拟唾液中，调节菌液 浓度至为1×109cfu/mL。于37℃孵育5min，4℃下6000r/min，离心10min，收集菌体； 将收集到的菌体继续重悬于pH 2.0的模拟胃液中，于37℃孵育3h，4℃下6000r/min，离 心10min，收集菌体；最后再将收集的菌体重悬于pH 8.0的模拟肠液中，于37℃孵育24 h，收集菌液，根据GB4789.2—2010进行活菌计数。计算公式同公式(2)。
[0111] 结果表明，菌株BLP12在经过模拟唾液、胃液、肠液消化后生长状况良好，存活率 为88.27％，基本达到了90％，经人体一系列消化后，能很好地存活于肠道。
[0112] (5)测定菌株BLP12的生长曲线
[0113] 取对数生长期的植物乳杆菌BLP12，按4％(v/v)的接种量接入MRS肉汤培养基中，在 37℃培养18h，每隔1h取样，测定其菌液OD600nm值。
[0114] 结果如图3所示，该菌株的生长周期较短，培养2h后即进入对数生长期，14h后进 入稳定期。
[0115] 一个优选方案中，将所述植物乳杆菌用于预防和治疗2型糖尿病。
[0116] 下面通过所述植物乳杆菌BLP12体内预防小鼠糖尿病试验，对本发明所述植物乳杆 菌对2型糖尿病具有良好的预防治疗效果进行具体说明，实验采用高脂饲料喂养加注射链 脲霉素(STZ)造成的2型糖尿病模型。
[0117] 实验用鼠为Balb/c小鼠，雄性，周龄4-5周，购自北京维通利华有限公司，合格证号： SCXK(京)2013－0001。饲养于中国医学科学院药用植物研究所SPF级动物房,许可证号：SYXK(京)2013-0023，室温22±2℃，相对湿度60％RH。定时12小时光照和12小时黑 暗，自由饮水取食，并定期更换垫料，定时清洗鼠笼。
[0118] 40只按体重随机分为4组：正常组、模型组、阳性药物组及BLP12组(除正常组， 均饲以高脂饲料，每组10只)。BLP12组预防性灌胃给药(所述植物乳杆菌菌样)两周后 造模，提前一天禁食不禁水12小时，腹腔注射100mg/kg链脲霉素(STZ，SIGMA),隔3 天重复注射一次。正常组饲喂基础饲料(粗蛋白含量19.2％，粗脂肪含量4.6％，粗纤维4.0％， 粗灰分6.3％，水分8.8％，无氮提取物55.9％)；模型组、阳性药物组(阿卡波糖(拜尔)) 以及BLP12组以高脂饲料饲喂(粗蛋白含量17.5％，粗脂肪含量17.9％，粗纤维3.1％， 粗灰分4.5％，
10
水分8.5％，无氮提取物48.5％)；BLP12组每天灌胃乳酸菌1×10 CFU/鼠。
[0119] 在给STZ诱导造模后一周，各组小鼠禁食不禁水12h，以血糖仪测定尾静脉血糖值， 为空腹血糖值。模型组空腹血糖值为11.3mmoL/L，正常组血糖值为3.7mmoL/L。模型组 的血糖组超过正常组血糖值的50％以上，即为2型糖尿病造模成功。
[0120] 造模成功后，阳性药物组每天灌胃10mg/kg，BLP12组每天灌胃250μL所述植物乳杆 菌菌样直至13周实验结束。空腹取血，测定空腹血糖值(如图4所示)，13周后，模型 组空腹血糖值为12.74mmoL/L，阳性药物组空腹血糖值为8.885mmoL/L，BLP12组空腹血 糖值为7.94mmoL/L，显著下降,甚至超过阳性药物组。糖基化血红蛋白是糖尿病评价指标 中的金指标，也被用来长期血糖调节的治疗效果。空腹取血，测定糖基化血红蛋白值(如 图5所示)，13周后，糖基化血红蛋白的趋势与空腹血糖值趋势一样，相比于模型组，BLP12 组的糖基化血红蛋白值有显著降低。表明本发明所述植物乳杆菌对2型糖尿病具有一定的 降血糖作用。
[0121] 一种具有α-葡萄糖苷酶高抑制活性的植物乳杆菌的应用方法，其中，将所述植物乳杆 菌加保护剂制成活性冻干菌粉，所述活性冻干菌粉的制作方法简单，所述活性冻干菌粉便 于储存和运输。
[0122] 下面通过具体实施例对所述活性冻干菌粉的制作方法作进一步说明。
[0123] 实施例1
[0124] 所述保护剂包括5％的脱脂乳以及0.5％的L-谷氨酸，所述的活性冻干菌粉的制备包括 以下步骤：
[0125] 步骤A、将所述菌株以4％的接种量接入MRS肉汤培养基中进行大批量发酵，于36℃ 培养16h，镜检确认无污染后，再将培养好的菌液于4℃下6000r/min，离心10min，收集 菌体；
[0126] 步骤B、将保护剂与菌体按体积比1:1的比例混合，进行冻干，即得含所述植物乳杆 菌的菌粉。
[0127] 实施例2
[0128] 所述保护剂包括10％的脱脂乳以及1.0％的L-谷氨酸，所述的活性冻干菌粉的制备包 括以下步骤：
[0129] 步骤A、将所述菌株以4％的接种量接入MRS肉汤培养基中进行大批量发酵，于37℃ 培养18h，镜检确认无污染后，再将培养好的菌液于4℃下6000r/min，离心10min，收集 菌体；
[0130] 步骤B、将保护剂与菌体按体积比1:2的比例混合，进行冻干，即得含所述植物乳杆 菌的菌粉。
[0131] 实施例3
[0132] 所述保护剂包括15％的脱脂乳以及1.5％的L-谷氨酸，所述的活性冻干菌粉的制备包 括以下步骤：
[0133] 步骤A、将所述菌株以4％的接种量接入MRS肉汤培养基中进行大批量发酵，于38℃ 培养20h，镜检确认无污染后，再将培养好的菌液于4℃下6000r/min，离心10min，收集 菌体；
[0134] 步骤B、将保护剂与菌体按体积比1:3的比例混合，进行冻干，即得含所述植物乳杆 菌的菌粉。
[0135] 在上述方案中，所述活性冻干菌粉中的植物乳杆菌具有α-葡萄糖苷酶高抑制活性，在 餐后一小时内服用，可防止糖尿病人血糖快速升高，将餐后2小时血糖水平维持在 11.1mmol/L以内，可降低糖尿病人因餐后长时间血糖水平较高而诱发各种并发症的可能性， 长期辅助治疗糖尿病；此外，所述冻干菌粉中的植物乳杆菌可在人体肠道内定植并生存， 通过快速繁殖产生代谢活性物质，能够很好地调节糖尿病人的肠道环境健康，使人体肠道 环境呈酸性，有利于消化和吸收，加强肠道蠕动。
[0136] 一种具有α-葡萄糖苷酶高抑制活性的植物乳杆菌的发酵方法，其中，将所述植物乳杆 菌接种到动物乳、豆乳、花生乳、青蔬或果汁中进行发酵，即得适于糖尿病人食用的功能 性食品。
[0137] 下面通过具体实施例对本发明所述的植物乳杆菌的发酵步骤作进一步说明。
[0138] 实施例4
[0139] 将所述植物乳杆菌接种到牛乳、羊乳或骆驼乳中进行发酵，发酵步骤如下：接种前， 将牛乳、羊乳或骆驼乳加热至75℃，保持10s进行消毒处理。待牛乳、羊乳或骆驼乳冷却 到40℃左右，接入所述植物乳杆菌，搅拌均匀至起泡。密封条件下，温度保持在40-41℃， 8h进行发酵，即得适于糖尿病人食用的发酵牛乳、发酵羊乳或发酵骆驼乳。
[0140] 实施例5
[0141] 将所述菌粉投入到豆乳或花生乳中进行发酵，发酵步骤如下：接种前，将豆乳或花生 乳加热至65℃，保持30min进行消毒处理。待豆乳或花生乳冷却到40℃左右，接入所述 植物乳杆菌，搅拌均匀至起泡。密封条件下，温度保持在40-41℃，8h进行发酵，即得适 于糖尿病人食用的发酵豆乳或发酵花生乳。
[0142] 实施例6
[0143] 将所述菌粉投入到青蔬或果汁中进行发酵，发酵步骤如下：接种前，将青蔬或果汁加 热至65℃，保持30min进行消毒处理。待青蔬或果汁冷却到40℃左右，接入所述植物乳 杆菌，搅拌均匀至起泡。密封条件下，温度保持在40-41℃，8h进行发酵，即得适于糖尿 病人食用的发酵青蔬或果汁。
[0144] 在上述方案中，将本发明所述植物乳杆菌应用于乳制品(如：动物乳、豆乳、花生乳 或其他乳类产品)的生产中，或者作为食品配料添加至功能性食品(如：青蔬、果汁或其 他食品)中，不仅适于糖尿病人食用，而且对于糖尿病和肥胖症均能够起到良好的预防及 干预效果。
[0145] 尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用， 它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现 另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特 定的细节和这里示出与描述的图例。
