[0029] 下面对本发明具体实施方式做一个详细的说明。
[0030] 实施例1灰黄青霉(P.griseofulvum)Pg-35菌株的分离、筛选和鉴定[0031] 1菌株
[0032] (1)青霉菌株：从不同的生境(例如：水稻田土壤、腐烂水果、面包等)分离、纯化、鉴定和保藏青霉菌株。
[0033] (2)水稻白叶枯病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzae，Xoo)P6小种。
[0034] 2培养基
[0035] (1)PDA培养基：马铃薯200g、葡萄糖20g、琼脂粉15-20g，水1L，pH 5.5～6.0。用于青霉菌株的分离纯化和鉴定。
[0036] (2)PD培养液：马铃薯200g、葡萄糖20g、水1L，pH 5.5～6.0。用于青霉菌株的发酵培养。
[0037] (3)水稻白叶枯病菌固体培养基(Xoo固体培养基)：马铃薯300g、蔗糖15g、Ca(NO3)20.5g、NaH2PO4·12H2O 2.0g、胰蛋白胨5.0g、琼脂15g、水1000mL、pH 6.5。用于水稻白叶枯病菌的固体培养。
[0038] (4)水稻白叶枯病菌培养液(Xoo培养液)：马铃薯300g，胰蛋白胨5g，蔗糖15g，Ca(NO3)·H2O 0.5g，Na2HPO4·12H2O 2g，水1L，pH 6.5。用于白叶枯病原菌P6小种发酵培养。
[0039] 3实验方法
[0040] 3.1青霉菌株的分离纯化和保藏
[0041] (1)腐烂水果等表面青霉菌株的分离纯化方法：用镊子挑取水果表面霉菌菌丝接种于PDA固体培养基中，28℃培养，待白色绒毛状菌丝长出后，挑取顶端菌丝纯化培养3次，得纯菌株。
[0042] (2)土壤中青霉菌株的分离纯化方法：取土样1g于99mL无菌水中，120r/min摇床上振荡30min。取上清液进行梯度稀释(10-2～10-8)，选择合适的浓度(10-6)取100μL均匀涂布于PDA培养基上，28℃恒温箱培养36h，直到出现不同形态丝状真菌的菌落。挑取单菌落转接到PDA培养基上，3次传代纯化，得纯菌株。
[0043] (3)青霉菌株的初步鉴定和编号保存：将上述纯菌株PDA培养基上，28℃培养3d，根据菌落形态和显微形态，对菌株进行初步鉴定，将具有青霉典型特征的菌株编号，并置于4℃冰箱中保存。
[0044] 3.2拮抗水稻白叶枯病的青霉菌株的筛选
[0045] 3.2.1共培养法初筛
[0046] 将白叶枯病菌P6小种接种于Xoo培养液中，摇床活化培养(180r/min、28℃)。当菌密度达到OD600为0.6时，取100μL菌液均匀涂布于Xoo固体培养基上，将已活化的青霉菌株菌饼(直径6mm)接种于Xoo固体培养基中间，28℃培养48h，观察抑菌圈。根据抑菌圈有无和大小初步筛选有拮抗作用的青霉菌株，并将其用25％甘油保藏。
[0047] 3.2.2牛津杯法复筛
[0048] (1)青霉菌株的发酵培养：将有拮抗作用的青霉菌株接种至新鲜PDA培养基平板中，于28℃培养箱中培养3d，用6mm打孔器取1菌饼接种到装有100mL PD培养液的250mL锥形瓶中摇床振荡培养(180r/min、28℃)7d后，得发酵滤液。
[0049] (2)水稻白叶枯病菌P6小种的培养：将P6小种接种于Xoo培养液中，摇床活化培养(180r/min、28℃)，当菌密度达到OD600为0.6时，取100μL菌液均匀涂布于Xoo固体培养基上。取200μL青霉菌株的发酵滤液，用牛津杯法测定各青霉菌株发酵液对P6小种的抑制作用。根据抑菌圈大小选择出拮抗作用较强的青霉菌株。
[0050] 3.3拮抗水稻白叶枯病菌青霉目标菌株的鉴定
[0051] 用镊子挑取少量青霉目标菌株菌丝，转接于PDA培养基平板中，活化培养3d；取平皿中1菌饼(直径6mm)接种于新的PDA培养基平板上，28℃培养3d，显微镜观察目标菌株的菌丝、分生孢子头、分生孢子梗、分生孢子等的形态特征，并拍照。
[0052] 提取目标菌株的基因组DNA，扩增ITS rDNA基因序列，送上海生物工程公司测序。将测序得到的ITS rDNA序列提交至GenBank并利用BLAST比对后进行分析，初步确定所属的种。
[0053] 4 实验结果
[0054] 4.1 青霉纯菌株的获得
[0055] 通过分离纯化从不同生境收集的自然发酵样品(土壤、水果、有机质等)中分离纯化共获60株青霉纯菌株。
[0056] 4.2拮抗水稻白叶枯病菌青霉菌株的筛选
[0057] 利用共培养法和牛津杯法对60株青霉纯菌株进行水稻白叶枯病菌的抑制效果的初筛和复筛，结果不同青霉菌株对白叶枯病菌抑制作用存在较大差异。经筛选获1株拮抗作用较强的青霉菌株，编号为Pg-35菌株，发酵液抑菌圈直径达46mm，青霉Pg-35分离于水稻田土壤。
[0058] 4.3青霉Pg-35菌株的鉴定结果
[0059] 形态特征：PDA上28℃培养12d，菌落直径达30～40mm；表面产生少量水珠；边缘为少量白色菌丝，背面产生黄褐色色素(附图1)。分生孢子梗发生于基质或在孢梗束和菌丝之中，壁平滑；帚状枝比较复杂，400倍显微镜下观察为两轮生，叉开，其分枝点通常1个，且分散；瓶梗每轮5～7个，5.0～7.5×2.0～2.5μm(附图2)；分生孢子近球形，壁平滑，分生孢子链呈现较紧密而叉开的圆柱状或近圆柱状(附图3)。
[0060] ITS rDNA基因序列：分析结果表明，青霉Pg-35菌株的ITS rDNA基因序列长度为525bp(附图4)，基于ITS rDNA基因序列建立的青霉属(Penicillium)系统发育树表明，与灰黄青霉(P.griseofulvum)的进化距离最近(附图5)。
[0061] 根据青霉Pg-35菌株的形态特征和ITS rDNA基因序列，结合青霉属(Penicillium)分种检索表，将Pg-35菌株鉴定为灰黄青霉(Penicillium griseofulvum)。
[0062] 实施例2灰黄青霉(Penicillium griseofulvum)Pg-35菌株发酵液抗菌谱测定[0063] 1菌株
[0064] (1)灰黄青霉(Penicillium griseofulvum)Pg-35菌株。
[0065] (2)4种植物病原真菌：小麦赤霉病菌(Gibberella fujikuroi)、番茄早疫病菌(Alternaria solani)、杨树枯萎病菌(Fusarium solani)、黄瓜枯萎病菌(Fusarium oxysporum f.sp.momordicae)，用作真菌抗菌谱测试。
[0066] 2培养基
[0067] (1)PDA培养基：马铃薯200g、葡萄糖20g、琼脂粉20g、水1L、pH 6.0～6.5。用于Pg-35菌株的活化培养和4种抗菌谱测定真菌的培养。
[0068] (2)PD培养液：马铃薯200g、葡萄糖20g、水1L、pH 6.0～6.5。用于青霉Pg-35菌株的发酵种子培养。
[0069] (3)发酵培养液：马铃薯200g、葡萄糖20g、蛋白胨5g、水1L、pH 6.0～6.5。用于Pg-35菌株发酵培养。
[0070] 3实验方法
[0071] 3.1青霉Pg-35菌株发酵滤液的制备
[0072] 刮取青霉Pg-35菌株PDA固体培养基少量孢子，接种于PD培养液中，装液量50/250mL、初始pH 6.5，180r/min，28℃恒温摇床培养48h，作为种子液。按照4％接种量将种子液接种于发酵培养液中，摇床发酵培养7d。将发酵液置于50mL离心管中12000r/min离心
10min，上清液用0.5μm有机滤膜过滤，除去残余孢子，得到发酵滤液。
[0073] 3.2 4种植物病原菌的活化与培养
[0074] 将保藏于4℃的4种病原菌分别接种于PDA培养基中，于28℃活化培养2d。然后转接于新的PDA培养基上于28℃培养4d，用于抗菌谱测定。
[0075] 3.3青霉Pg-35菌株抗菌谱的测定
[0076] 将发酵滤液与处于熔化状态55℃的PDA固体培养基以1:9体积比例混合均匀，倒入培养皿中，制成含发酵滤液的平板。用打孔器移取带有待测4种植物病原真菌、直径为6mm的菌饼置于上述平板中央。28℃恒温培养72h。用十字交叉法测量4种植物病原真菌的菌落生长直径，设置3组平行重复，取平均值。按照下列抑制率计算公式计算菌丝生长抑制率。
[0077] 抑制率％＝对照菌落直径-处理菌落直径)/(对照菌落直径-6)×100
[0078] 4实验结果
[0079] 测定结果表明：青霉Pg-35菌株发酵液对4种植物病原真菌均较好的抑制作用。对杨树枯萎病菌(Fusarium solani)、小麦赤霉病菌(Gibberella fujikuroi)、黄瓜枯萎病菌(Fusarium oxysporum f.sp.momordicae)和番茄早疫病菌(Alternaria solani)的菌丝生长抑制率分别为46.66％、40.07％、32.27％和30.54％(表1，附图7)。
[0080] 表1青霉Pg-35菌株发酵滤液对4种植物病原菌的抑制效果
[0081]
[0082] 注：菌丝生长抑制率(％)＝(对照菌落直径-处理菌落直径)/(对照菌落直径-6)×100
