[0009] 本发明的目的在于克服现有技术所存在的缺陷，提供了一种操作简便，成本低廉，能在生产水平高产量合成具备高活性的黄酮类化合物的方法。
[0010] 为了实现上述目的，本发明采用的技术方案由下述步骤组成：
[0011] (1)一级种子的培养
[0012] 将斜面保藏的活化好的桑黄菌种接种到种子培养基中进行一级种子培养，接种量是每100ml的种子培养基中接入4～5块大小为5mm×5mm的菌块，培养温度为27～30℃，转速为150～180r/min，培养时间为7～9天；
[0013] 上述的1L种子培养基中：葡萄糖为15.0～22.0g、土豆为150.0～220.0g、KH2PO4为0.5～2.5g、MgSO4为0.2～0.5g，加水至1L,该种子培养基的pH为6.5；
[0014] (2)二级种子的培养
[0015] 将步骤(1)中的培养好的一级种子接到种子培养基中进行二级种子培养，接种量为5～15(V/V)％，培养温度为27～30℃，转速为150～180r/min，培养时间为7～9天，得到培养的二级种子；
[0016] (3)发酵培养
[0017] 将步骤(2)的培养好的二级种子接到发酵培养基中，接种量为5～15(V/V)％，培养温度为27～30℃，转速为150～180r/min，培养4～5天向发酵培养基中加入D-101大孔树脂，继续培养3～4天；
[0018] 1L发酵培养基中：葡萄糖为15.0～22.0g、蛋白胨为2.0～7.0g、香豆素为0.02～0.06g、苯丙氨酸为0.2～0.6g、吐温-80为1.0～4.0g、肉桂酸0.05～ 0.5g、MgSO4为1.0～
5.0g、KH2PO4为0.5～3.0g，加水至1L，该发酵培养基的pH为6.5；
[0019] (4)提取桑黄活性黄酮类化合物
[0020] 在步骤(3)的发酵培养完成后过滤出D-101大孔树脂，利用D-101大孔树脂将发酵培养基中的黄酮类化合物吸附出来，用80％的甲醇洗脱出来，得到桑黄活性黄酮类化合物。
[0021] 上述步骤(1)中的桑黄菌种的名称为Phellinus sp.P0988，保藏号为CCTCC NO:M2012080,保藏单位是中国典型培养物保藏中心，地址是中国武汉武汉大学，邮编430012，保藏日期是2012年3月14日。
[0022] 上述步骤(3)的优选配方是：1L发酵培养基中葡萄糖为18.0～20.0g、蛋白胨为3.0～5.0g、香豆素为0.02～0.04g、苯丙氨酸为0.25～0.5g、肉桂酸为0.05～0.3g、MgSO4为1.0～3.0g、KH2PO4为0.5～2.0g、吐温-80为1.0～3.0g，加水至1L，该发酵培养基的pH为6.5。
[0023] 本发明合成桑黄高活性黄酮类化合物的方法，主要是在对桑黄发酵合成的培养基进行了优化，其技术优势如下所示：
[0024] (1)通过响应面设计优化方法研究了影响桑黄合成黄酮类化合物产率和生物活性的培养基成分以及其相互之间存在的交互作用。在统计学分析基础上确定了显著影响桑黄合成黄酮类化合物产率和活性的重要培养基成分香豆素、苯丙氨酸和吐温-80之间的交互作用和主体影响，从而确定了这些培养基成分最有利于桑黄合成黄酮类化合物产率和活性形成的浓度范围。这在黄酮类化合物的合成上是从来没有被公示或报道过的。
[0025] (2)通过在其发酵培养基中加入了香豆素、苯丙氨酸等形成黄酮类化合物的骨架前体物质，减少了桑黄合成该类物质的代谢过程，缩短了生产周期，促 进了桑黄合成过程中的高活性形成过程。
[0026] (3)本发明还加入了肉桂酸，作为次级代谢产物的刺激物，促进黄酮的合成和活性形成过程。
[0027] (4)本方法操作简便，成本低廉，可获得高产量高活性的黄酮类化合物，在食品及医药技术领域有广泛应用，因此，本发明对于工业化生产黄酮类化合物，具有重要意义具体实施方式
[0028] 以下将结合实验作出进一步说明。
[0029] 实施例1
[0030] 本实施例合成桑黄高活性黄酮类化合物的方法由以下步骤组成：
[0031] (1)一级种子培养
[0032] 将斜面保藏的活化好的桑黄菌种接种到种子培养基中进行一级种子培养，接种量是每100ml的种子培养基中接入4块大小为5mm×5mm的菌块，培养温度28℃，转速160r/min，培养时间9天。
[0033] 桑黄菌种是按照常规方法活化，具体是将桑黄菌种接种在PDA培养基上，25～30℃，有氧避光培养至桑黄菌种长满斜面；该桑黄菌种的名称为Phellinus sp.P0988，保藏单位为中国典型培养物保藏中心，地址是中国武汉武汉大学，邮编430012，保藏编号为CCTCC NO：M 2012080，保藏日期是2012年3月14日。
[0034] 上述的1L种子培养基中：葡萄糖20.0g、土豆200.0g、KH2PO4 1g、MgSO4 0.5g，余量为水，该种子培养基的pH为6.5。
[0035] (2)二级种子培养
[0036] 将步骤(1)中的培养好的一级种子接到种子培养基中进行二级种子培养， 接种量为10(V/V)％，即每100mL的种子培养基中接种10mL的一级种子，培养温度为28℃，转速为160r/min，培养时间为9天，得到的二级种子。
[0037] (3)发酵培养
[0038] 将步骤(2)中的培养好的二级种子接到发酵培养基中，接种量为10(V/V)％，即每100mL的发酵培养基中接种10mL的二级种子，培养温度为28℃，转速为160r/min，培养4天，向发酵培养基中加入D-101大孔树脂进行吸附，继续培养4天；
[0039] 上述的1L发酵培养基中：葡萄糖20.0g、蛋白胨4g、香豆素0.03g、苯丙氨酸0.35g、肉桂酸0.1g、MgSO4 1.5g、KH2PO4 1.0g、吐温-80 2.0g，加水至1L，该发酵培养基的pH为6.5。
[0040] (4)提取桑黄活性黄酮类化合物
[0041] 在步骤(3)的发酵培养完成后过滤出D-101大孔树脂，利用D-101大孔树脂将发酵培养基中生成的黄酮类化合物吸附出来，用80％的甲醇洗脱出来，获得桑黄活性黄酮类化合物，并测定出黄酮类化合物的含量为5.76g/L，总抗氧化活性为5.15mmol/L。
[0042] 实施例2
[0043] 本实施例合成桑黄高活性黄酮类化合物的方法由以下步骤组成：
[0044] (1)一级种子培养
[0045] 将斜面保藏的活化好的桑黄菌种接种到种子培养基中进行一级种子培养，接种量是每100ml的种子培养基中接入5块大小为5mm×5mm的菌块，培养温度27℃，转速180r/min，培养时间8天；
[0046] 上述的1L种子培养基中：葡萄糖18.0g、土豆180.0g、KH2PO4 1g、MgSO4 0.5g，加水至1L，该种子培养基的pH为6.5。
[0047] (2)二级种子培养
[0048] 将步骤(1)中的培养好的一级种子接到种子培养基中进行二级种子培养，接种量为15(V/V)％，即每100mL的种子培养基中接种15mL的一级种子，培养温度为27℃，转速为180r/min，培养时间为8天，得到二级种子。
[0049] (3)发酵培养
[0050] 将步骤(2)中的培养好的二级种子接到发酵培养基中，接种量为15(V/V)％，即每100mL的发酵培养基中接种15mL的二级种子，培养温度为27℃，转速为150r/min，培养5天，向发酵培养基中加入D-101大孔树脂进行吸附，继续培养3天；
[0051] 上述的1L发酵培养基中：葡萄糖18.0g、蛋白胨3g、香豆素0.04g、苯丙氨酸0.4g、肉桂酸0.3g、MgSO4 4.0g、KH2PO4 0.5g、吐温-80 1.0g，加水至1L，该发酵培养基的pH为6.5。
[0052] (4)提取桑黄活性黄酮类化合物
[0053] 在步骤(3)的发酵培养完成后过滤出D-101大孔树脂，利用D-101大孔树脂将发酵培养基中生成的黄酮类化合物吸附出来，用80％的甲醇洗脱出来，获得桑黄活性黄酮类化合物，并测定出黄酮类化合物的含量为4.054g/L，总抗氧化活性为5.1964mmol/L。
[0054] 实施例3
[0055] 本实施例合成桑黄高活性黄酮类化合物的方法由以下步骤组成：
[0056] (1)一级种子培养
[0057] 将斜面保藏的活化好的桑黄菌种接种到种子培养基中进行一级种子培养，接种量是每100ml的种子培养基中接入5块大小为5mm×5mm的菌块，培养温度30℃，转速150r/min，培养时间9天；
[0058] 上述的1L种子培养基中：葡萄糖22.0g、土豆150.0g、KH2PO4 0.5g、MgSO4 0.5g,加水至1L，该种子培养基的pH为6.5。
[0059] (2)二级种子培养
[0060] 将步骤(1)中的培养好的一级种子接到种子培养基中进行二级种子培养，接种量为5(V/V)％，即每100mL的种子培养基中接种5mL的一级种子，培养温度为30℃，转速为150r/min，培养时间为9天，得到二级种子。
[0061] (3)发酵培养
[0062] 将步骤(2)中的培养好的二级种子接到发酵培养基中，接种量为5(V/V)％，即每100mL的发酵培养基中接种5mL的二级种子，培养温度为30℃，转速为180r/min，培养4天，向发酵培养基中加入D-101大孔树脂进行吸附，继续培养3天；
[0063] 上述的1L发酵培养基中：葡萄糖20.0g、蛋白胨5g、香豆素0.02g、苯丙氨酸0.5g、肉桂酸0.05g、MgSO4 1.0g、KH2PO4 2.0g、吐温-80 3.0g，加水至1L，该发酵培养基的pH为6.5。
[0064] (4)提取桑黄活性黄酮类化合物
[0065] 在步骤(3)的发酵培养完成后过滤出D-101大孔树脂，利用D-101大孔树脂将发酵培养基中生成的黄酮类化合物吸附出来，用80％的甲醇洗脱出来，获得桑黄活性黄酮类化合物，并测定出其含量为4.73g/L，总抗氧化活性为6.4mmol/L。
[0066] 实施例4
[0067] 本实施例中，步骤(1)的种子培养基配方是：葡萄糖15.0g、土豆220.0g、KH2PO4 2.5g、MgSO4 0.2g,加水至1L，该种子培养基的pH为6.5。
[0068] 步骤(3)中所用发酵培养基的配方是：葡萄糖15.0g、蛋白胨2g、香豆素 0.06g、苯丙氨酸0.6g、肉桂酸0.5g、MgSO4 5.0g、KH2PO4 3.0g、吐温-80 4.0g，加水至1L，该发酵培养基的pH为6.5。
[0069] 其他的操作均与实施例1相同，且产率和总抗氧化活性均与实施例1的结果接近。
[0070] 实施例5
[0071] 本实施例中，步骤(1)的种子培养基配方是：葡萄糖22.0g、土豆150.0g、KH2PO4 2.0g、MgSO4 0.3g,加水至1L，该种子培养基的pH为6.5。
[0072] 步骤(3)中所用发酵培养基的配方是：葡萄糖22.0g、蛋白胨7.0g、香豆素0.02g、苯丙氨酸0.2g、肉桂酸0.05g、MgSO4 1.0g、KH2PO4 0.5g、吐温-80 1.0g，加水至1L，该发酵培养基的pH为6.5。
[0073] 其他的操作均与实施例1相同，且产率和总抗氧化活性均与实施例1的结果接近。
[0074] 为了验证本发明的技术效果，申请人做了大量的实验，现以下述实验为例进行说明。
[0075] (1)发酵培养基对比
[0076] 对比例1的发酵培养基中：葡萄糖20.0g、蛋白胨4g、KH2PO4 1.0g、MgSO4 1.5g、肉桂酸0.1g、pH为6.5。
[0077] 对比例2的发酵培养基中：葡萄糖20.0g、蛋白胨4g、KH2PO4 1.0g、MgSO4 1.5g、肉桂酸0.1g、香豆素0.03g、pH为6.5。
[0078] 对比例3的发酵培养基中：葡萄糖20.0g、蛋白胨4g、KH2PO4 1.0g、MgSO4 1.5g、肉桂酸0.1g、苯丙氨酸0.35g、pH为6.5。
[0079] 对比例4的发酵培养基中：葡萄糖20.0g、蛋白胨4g、KH2PO4 1.0g、MgSO4 1.5g、肉桂酸0.1g、吐温-80 2.0g、pH为6.5。
[0080] 其他的步骤均与实施例1相同，所得实验结果如下表1：
[0081] 表1为各对比例与实施例1的结果对比
[0082]黄酮类化合物 实施例1 对比例1 对比例2 对比例3 对比例4
产量 5.76g/L 1.90g/L 2.63g/L 2.95g/L 3.35g/L
总抗氧化活性 5.15mmol/L 0.74mmol/L 1.44mmol/L 3.64mmol/L 1.45mmol/L [0083] 由表1可以看出，当分别加入香豆素、苯丙氨酸和吐温-80时，都可以提高黄酮类化合物产量和活性，但是效果并不明显，而当同时加入三者，则大大提高了黄酮类化合物的产量和活性，这充分证明香豆素、苯丙氨酸和吐温-80具有协同作用，而且这三者对黄酮类化合物的合成具有促进作用。
[0084] 为验证本实验中三者的关系，结合以下实验来分析：
[0085] 根据响应面法中的中心复合实验的设计原理，分别用X1、X2、X3来代表香豆素、苯丙氨酸和吐温-80，再按这3个自变量的低、中、高水平分别以-1、0、1进行编码。分别以桑黄黄酮类化合物含量和其总抗氧化活性为响应值设计实验，进一步选择显著因子的最优配置浓度以及分析三者之间的关系，响应面实验设计与结果见表2。
[0086] 表2响应面实验设计与结果
[0087]
[0088]
[0089] 以黄酮类化合物含量为响应值，根据上表中CCD设计实验结果，运用Minitab软件对其中的结果进行二次回归分析，得到二次回归方程：
[0090] Y＝0.16458-0.1394X1+0.0406X2+0.1374X3+0.24055X12+0.40255X22+1.29355X32+0.26913X1X2+0.43137X1X3+1.58812X2X3
[0091] 回归方程的方差分析见表3
[0092] 表3回归方程的方差分析
[0093]
[0094] 以黄酮类化合物的总抗氧化活性为响应值，根据表2中CCD设计的实验结果，运用Minitab软件对其进行二次回归分析，得到二次回归方程为
[0095] Y＝0.775-0.224X1+0.124X2-0.086X3+0.48X12+0.52X22+1.42X32+0.37X1X2+0.55 X1X3+1.68X2X3
[0096] 回归方程的方差分析见表4
[0097] 表4回归方程的方差分析
[0098]
[0099] 由表3和表4可以看出，方程的交互作用非常显著(P<0.001)，而且方程的线性、平方项也很显著，说明各个实验因子对黄酮类化合物的影响不是简单的线性关系，它们对黄酮类化合物的产量和抗氧化活性都有影响，进一步说明香豆素、苯丙氨酸和吐温-80之间具有相互协调，相互作用的关系。
[0100] (2)香豆素的添加量对黄酮类化合物的影响
[0101] 对比例4的发酵培养基中：葡萄糖20.0g、蛋白胨4g、香豆素0.1g、苯丙氨酸1.0g、MgSO4 1.5g、KH2PO4 1.0g、吐温-80 2.0g、pH为6.5。
[0102] 对比例5的发酵培养基中：葡萄糖20.0g、蛋白胨4g、香豆素0.005g、苯丙氨酸0.05g、MgSO4 1.5g、KH2PO4 1.0g、吐温-80 2.0g、pH为6.5。
[0103] 其他的步骤均与实施例1相同，所得实验结果如下表5：
[0104] 表5为各对比例与实施例1的结果对比
[0105]黄酮类化合物 实施例1 对比例4 对比例5
产量 5.76g/L 1.13g/L 1.99g/L
总抗氧化活性 5.15mmol/L 1.11mmol/L 1.91mmol/L
[0106] 由表5可以看出不同含量的香豆素对黄酮类化合物产量和黄酮类化合物活性有不同的影响，超过本配方中香豆素的含量时，黄酮类化合物的含量和活性 会降低，说明香豆素含量过高会抑制黄酮类化合物的合成，而低于本配方中香豆素的含量时，黄酮类化合物的含量和活性也会降低，这说明香豆素含量过低，与其他因素相互作用的效果较弱，不利于黄酮类化合物的合成。
