[0027] 以下结合具体实施方式和附图对本发明的技术方案作进一步详细描述:
[0028] 本发明中抗生素培养液还包括以下成分:350mg硝酸钠、50mg甘油磷酸钠、25ml铁与EDTA的1:1摩尔比混合液、500mg Tris、100μg碘化钾,用高压灭菌海水定容到100ml。
[0029] 本发明中外植体培育不定芽用培养基包括以下成分:350mg硝酸钠、50mg甘油磷酸钠、25ml铁与EDTA的1:1摩尔比混合液、10μg维生素B12、0.5mg硫胺、5μg生物素、500mg Tris,用高压灭菌海水定容到100ml。
[0030] 本发明中高压灭菌海水制备步骤如下:将海水过滤后,在0.1~0.2MPa压力下,灭菌20~40min,冷却即得。
[0031] 实施例1:
[0032] 培育用于吸附废水中金属离子的鼠尾藻的方法,包括,提供外植体,然后将外植体在辐照条件下培育出不定芽,再将不定芽进行扩繁培育;上述辐照条件包括电磁波。该方法通过组织培养,可完成鼠尾藻苗种的规模化培育,且由于培育过程中细胞周期蛋白相关基因表达量增加,形成了侧枝较多的芽苗,且对幼苗在附着基上的附着能力和对重金属离子的耐受力都进行了强化培育,进而获得吸附和去除能力更强的鼠尾藻幼苗及植株。
[0033] 植体由鼠尾藻固着器制备。鼠尾藻是多年生的大型海藻,附着在岩礁上的固着器可以不断地萌发出新的藻体,成簇的幼嫩的新枝在固着器上生长出来,因此固着器是鼠尾藻的生长点,具有强大的分生能力,因此被选取作为组织培养的外植体来源。
[0034] 固着器使用前,消毒并暂养于抗生素培养液中2天;暂养温度为18℃,光照强度为1000lx,光照周期为明:暗=14:10h。消毒处理用消毒剂具有烧蚀性,在杀灭细菌的同时,也会作用于正常的细胞组织,影响正常细胞的成长或再生,所以外植体消毒后要对组织细胞进行暂养,以清除残留的具有杀伤力的消毒剂,保证后续培养用组织细胞生长活性处于较高水平。
[0035] 抗生素培养液中包括0.1g链霉素、10mg新霉素和0.5mg制霉菌素。向暂养培养液中添加抗生素,可以使得组织细胞在暂养过程中仍然处于无菌状态,避免外植体被污染。
[0036] 外植体培育不定芽的条件如下:温度为16℃,光照强度为4000lx,光照周期为明:暗=14:10h,培养基每隔4周更换一次,培育4个月。在上述条件下,外植体中处于分化状态的细胞处于分裂状态,细胞体积随着再生分化速不断增大,继而分化为胚性细胞,促进分化基因的表达,从而使细胞朝着器官分化的方向发展,在较短时间内形成不定芽。
[0037] 电磁波为60Co‑γ射线,辐照剂量为10Gy。60Co‑γ射线具有很强的穿透性,是一种高能电磁波,在再生分化阶段对处于分化状态的细胞进行辐照,外植体除了形成透明愈伤组织以外,射线对部分细胞形成创伤,并促进和增加细胞周期蛋白相关基因的表达,打破了细胞的正常分化周期,在表层细胞上分化形成丝状体,这种丝状体容易游离并形成细胞簇,继而发育成侧枝较多的芽苗,扩大不定芽生成率,有利于后期芽苗生根后,分离出更多幼苗,实现人工大量繁殖培育的目的。
[0038] 辐照是在开始培育阶段和每次更换完培养基后立即进行。这种间隔式辐照对细胞在不同阶段的特异性分化起促进作用,辐照间隙有利于形成创伤的细胞进行自愈,部分自愈形成愈伤组织,而部分则进行丝状体分化。
[0039] 不定芽进行扩繁培育采用流动养殖和驯化培养相结合的方式。扩繁培育可诱导不定芽生根,通过物理和化学条件的刺激,植物体内生物酶的活性发生变化,诱导根部细胞再生,促使植物快生根、多生根,不定芽发育形成幼苗,继而长成完整的植株,完成培育。
[0040] 流动养殖中所用无菌海水的流速为0.5m/s,水深40cm。在流水刺激下,鼠尾藻生长迅速,保证苗种粗壮,且能提前长出气囊和生殖托,有利于后期扩大生产规模,流动养殖还可以使鼠尾藻芽苗适应流水的冲击,在移栽后可以牢固地附着在附着基上,适应潮汐冲击。
[0041] 驯化培养是向所用无菌海水中添加浓度总计为0.1mmol/L的重金属离子溶液,对鼠尾藻进行驯化;上述重金属离子重金属离子为铜、铬、铅、镉离子等量混合。鼠尾藻可利用其生物吸附能力对重金属离子进行吸附和去除,在培育阶段用微量重金属离子对幼苗进行驯化,可通过驯化获得具有更高耐受力的苗种,以此获得吸附和去除能力更强的鼠尾藻幼苗及植株。
[0042] 实施例2:
[0043] 培育用于吸附废水中金属离子的鼠尾藻的方法,具体步骤如下:
[0044] 1)取鼠尾藻固着器清洗后,用体积浓度为80%的酒精消毒15s,然后用体积浓度为2%的聚维酮碘溶液消毒15s,再用体积浓度为2%的次氯酸钠溶液消毒15min,用灭菌海水冲洗,然后置于包括0.2g链霉素、20mg新霉素和1.5mg制霉菌素的抗生素培养液中,于温度
22℃、光照强1500lx、光照周期明:暗=14:10h的条件下暂养2天;
[0045] 2)在超净工作台里,将固着器从抗生素培养液中取出,用灭菌海水冲洗干净,然后3
转移到灭菌的表面皿,用刀将固着器外周被漂白了的表皮切去,将中心部分切成2mm大小的块状,即得固着器外植体;
[0046] 3)将固着器外植体置于培育不定芽用培养基中,用辐照剂量为15Gy的60Co‑γ射线照射,然后于温度18℃、光照强度6000lx、光照周期明:暗=14:10h的条件下培育3.5个月,60
培养基每隔4周更换一次,每次更换完培养基后立即用辐照剂量为15Gy的 Co‑γ射线照射,可得不定芽;
[0047] 4)将不定芽固定在砖块附着基上,用流速为1.5m/s、深度为80cm的无菌海水流动养殖,上述无菌海水中添加浓度总计为0.1mmol/L的重金属离子溶液,对鼠尾藻进行驯化培育,重金属离子为铜、铬、铅、镉离子等量混合,上述养殖温度为20℃,采用普通日光照射。
[0048] 实施例3:
[0049] 培育用于吸附废水中金属离子的鼠尾藻的方法,具体步骤如下:
[0050] 1)取鼠尾藻固着器清洗后,用体积浓度为80%的酒精消毒15s,然后用体积浓度为2%的聚维酮碘溶液消毒15s,再用体积浓度为2%的次氯酸钠溶液消毒15min,用灭菌海水冲洗,然后置于包括0.15g链霉素、15mg新霉素和0.5mg制霉菌素的抗生素培养液中,于温度
20℃、光照强度1500lx、光照周期明:暗=14:10h的条件下暂养3天;
[0051] 2)在超净工作台里,将固着器从抗生素培养液中取出,用灭菌海水冲洗干净,然后3
转移到灭菌的表面皿,用刀将固着器外周被漂白了的表皮切去,将中心部分切成2mm大小的块状,即得固着器外植体;
[0052] 3)将固着器外植体置于培育不定芽用培养基中,用辐照剂量为12Gy的60Co‑γ射线照射,然后于温度16℃、光照强度5000lx、光照周期明:暗=14:10h的条件下培育3个月,培60
养基每隔4周更换一次,每次更换完培养基后立即用辐照剂量为12Gy的 Co‑γ射线照射,可得不定芽;
[0053] 4)将不定芽固定在砖块附着基上,用流速为1m/s、深度为60cm的无菌海水流动养殖,上述无菌海水中添加浓度总计为0.08mmol/L的重金属离子溶液,对鼠尾藻进行驯化培育,重金属离子为铜、铬、铅、镉离子等量混合,上述养殖温度为18℃,采用普通日光照射。
[0054] 实施例4:
[0055] 培育用于吸附废水中金属离子的鼠尾藻的方法,与实施例3不同之处在于:步骤4)中所用无菌海水中还包括0.03mM的氨茴酸甲酯和0.07mM的5‑氨基酮戊酸,上述5‑氨基酮戊酸被鼠尾藻吸收后,可参与叶绿素a的合成和积累过程中,有利于鼠尾藻光合作用进行,另外5‑氨基酮戊酸和氨茴酸甲酯协同作用,促进鼠尾藻体内果聚糖合成酶的相关表达,使得鼠尾藻幼苗中可溶性糖含量升高,而可溶性糖含量的增加,使得鼠尾藻幼苗在渗透压改变的环境下,仍能维持细胞内的正常水分,具有渗透调节作用,以此增强植物的抗逆性,有利于提高幼苗的移栽成活率。其他步骤与实施例3中一致。
[0056] 实施例5:
[0057] 培育用于吸附废水中金属离子的鼠尾藻的方法,与实施例3不同之处在于:步骤3)60
中未使用 Co‑γ射线进行辐照培养。其他步骤与实施例3中一致。
[0058] 实施例6:
[0059] 培育用于吸附废水中金属离子的鼠尾藻的方法,与实施例3不同之处在于:步骤4)中未使用无菌海水进行流动养殖,仅采用驯化培养的方式对不定芽进行扩繁培育。其他步骤与实施例3中一致。
[0060] 实施例7:
[0061] 培育用于吸附废水中金属离子的鼠尾藻的方法,与实施例3不同之处在于:步骤4)中未使用重金属离子的驯化培养,仅采用无菌海水流动养殖的方式对不定芽进行扩繁培育。其他步骤与实施例3中一致。
[0062] 实施例8:
[0063] 培育用于吸附废水中金属离子的鼠尾藻的方法,与实施例3不同之处在于:步骤4)的具体步骤为:将不定芽固定在砖块附着基上,用深度为60cm的无菌海水在温度为18℃、普通日光照射的条件下静态养殖扩繁。其他步骤与实施例3中一致。
[0064] 实施例9:
[0065] 鼠尾藻外植体在培养基中的形态学变化
[0066] 取实施例3中经辐照后的外植体,用荧光倒置显微镜在明视场下直接观察,并对外植体中形成的丝状体和丝状体形成的细胞团进行拍照,如附图1、2。
[0067] 实施例10:
[0068] 鼠尾藻幼苗体内生化组成成分及含量测定
[0069] 分别取实施例3和实施例4中扩繁培育4个月后的鼠尾藻植株,统一选取植株叶片,并对叶片细胞中的叶绿素和可溶性糖含量进行测定,测定结果如附图3所示。
[0070] 结果说明,叶绿素和可溶性糖含量均有所增加,叶绿素含量增加量较小,是由于叶绿素合成过程较复杂,同时也会受到光合作用的影响,因此变化不显著;可溶性糖含量增加显著,说明实施例4中添加的5‑氨基酮戊酸和氨茴酸甲酯增益作用明显,有利于增强植物的抗逆性,提高幼苗的移栽成活率。
[0071] 实施例11:
[0072] 鼠尾藻对重金属离子的吸附试验
[0073] 分别取实施例3~8所得鼠尾藻幼苗,附着在相同附着基上,置于pH为6的金属离子混合溶液中,上述混合溶液中的包括浓度分别为800mg/L、1000mg/L、500mg/L、800mg/L的铜、铬、铅、镉离子,鼠尾藻幼苗的投放量为20g/L,在鼠尾藻投放60min后,对溶液进行测定,其结果如下表1。
[0074] 表1鼠尾藻对重金属离子的吸附试验
[0075] Cu2+吸附率% Cr2+吸附率% Pb2+吸附率% Cd2+吸附率%实施例3 92.5 97.6 94.3 98.3
实施例4 93.6 97.3 94.6 98.4
实施例5 91.7 95.4 90.6 96.1
实施例6 91.8 95.6 91.2 96.3
实施例7 86.5 90.3 83.1 90.1
实施例8 87.6 90.4 82.6 90.5
[0076] 由上表可知,实施例3和4的幼苗对重金属离子吸附效果最好,且两组结果差异不明显;实施例5和6的幼苗对重金属离子吸附效果次之,且两组结果差异不明显,说明辐照和流水养殖对鼠尾藻的吸附能力产生了间接影响;实施例7和8的幼苗对重金属离子吸附效果最差,且两组结果差异不明显,说明培育期间使用微量金属离子对幼苗进行驯化,有利于废水中高浓度金属离子的吸附和去除。
[0077] 上述实施例中的常规技术为本领域技术人员所知晓的现有技术,故在此不再详细赘述。
[0078] 以上实施方式仅用于说明本发明,而并非对本发明的限制,本领域的普通技术人员,在不脱离本发明的精神和范围的情况下,还可以做出各种变化和变型。因此,所有等同的技术方案也属于本发明的范畴,本发明的专利保护范围应由权利要求限定。