[0029] 下面结合具体实施例对本发明作更进一步的说明,以便本领域的技术人员更了解本发明,但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例,凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
[0030] 实施例1
[0031] 取黄芪280g、麻罕80g、当归190g、墨旱莲220g、苍术190g、红花150g、赤芍140g、桃仁140g、牛膝150g、川芎120g、枳壳70g、桔梗100g,将麻罕、当归、苍术、桃仁、川芎加入到CO2超临界萃取器中,乙醇作为夹带剂,夹带剂占总萃取溶剂的体积百分比为5%,萃取压力25MPa,温度40℃,CO2流量2ml/g生药·min,萃取时间200min,得超临界萃取物,备用;取其余中药,粉碎,加入1.6L的50%乙醇,投入微波萃取装置中进行微波萃取,萃取功率700W,萃取2次,每次8分钟,合并萃取液,浓缩,加到Dl01大孔吸附树脂柱上,50%乙醇洗脱,收集5倍量柱体积洗脱液,减压回收乙醇,浓缩并干燥,得微波提取物,备用;将上述超临界萃取物和微波提取物混合,加入淀粉,70%乙醇制颗粒,干燥,压片,制成300片,每片重0.3g。
[0032] 经检测,成品中芍药苷的含量为7.8mg/片。
[0033] 实施例2
[0034] 取黄芪280g、麻罕80g、当归190g、墨旱莲220g、苍术190g、红花150g、赤芍140g、桃仁140g、牛膝150g、川芎120g、枳壳70g、桔梗100g,将麻罕、当归、苍术、桃仁、川芎加入到CO2超临界萃取器中,乙醇作为夹带剂,夹带剂占总萃取溶剂的体积百分比为4%,萃取压力30MPa,温度50℃,CO2流量3ml/g生药·min,萃取时间180min,得超临界萃取物,备用;取其余中药,粉碎,加入1.6L的50%乙醇,投入微波萃取装置中进行微波萃取,萃取功率600W,萃取2次,每次5分钟,合并萃取液,浓缩,加到Dl01大孔吸附树脂柱上,50%乙醇洗脱,收集5倍量柱体积洗脱液,减压回收乙醇,浓缩并干燥,得微波提取物,备用;将上述超临界萃取物和微波提取物混合,加入淀粉,70%乙醇制颗粒,干燥,压片,制成300片,每片重0.3g。
[0035] 经检测,成品中芍药苷的含量为5.6mg/片。
[0036] 实施例3
[0037] 取黄芪280g、麻罕80g、当归190g、墨旱莲220g、苍术190g、红花150g、赤芍140g、桃仁140g、牛膝150g、川芎120g、枳壳70g、桔梗100g,将麻罕、当归、苍术、桃仁、川芎加入到CO2超临界萃取器中,乙醇作为夹带剂,夹带剂占总萃取溶剂的体积百分比为6%,萃取压力15MPa,温度30℃,CO2流量1ml/g生药·min,萃取时间220min,得超临界萃取物,备用;取其余中药,粉碎,加入1.6L的50%乙醇,投入微波萃取装置中进行微波萃取,萃取功率800W,萃取2次,每次10分钟,合并萃取液,浓缩,加到Dl01大孔吸附树脂柱上,50%乙醇洗脱,收集5倍量柱体积洗脱液,减压回收乙醇,浓缩并干燥,得微波提取物,备用;将上述超临界萃取物和微波提取物混合,加入淀粉,70%乙醇制颗粒,干燥,压片,制成300片,每片重0.3g。
[0038] 经检测,成品中芍药苷的含量为6.2mg/片。
[0039] 实施例4:益康补元片抑制小鼠淋巴瘤细胞YAC-1细胞增殖的实验研究资料[0040] 1.实验材料
[0041] 1.1实验用细胞株
[0042] 小鼠淋巴瘤细胞YAC-1细胞,山东大学实验室细胞库,DMEM+10%FBS常规培养。
[0043] 1.2实验药物
[0044] 研究药物:本发明益康补元片:按实施例1方法制备。
[0045] 药液储液:称取100mg益康补元片,溶于5ml无水乙醇中,0.2μm滤器过滤,500μldoff管分装,-20℃存储,同时0.2μm滤器过滤无水乙醇以备对照组之用。
[0046] 1.3实验试剂
[0047] DMEM(GIBCO公司Cat.No.12100-061Lot.No.758137);胎牛血清(浙江天杭生物科技有限公司Lot.No.100419);NaHCO3(上海久亿化学试剂有限公司Cat.No.11810-033Lot.No.1088387);Trypsin(AMRESCO公司);EDTA(AMRESCO公司);Penicillin G Sodium Salt(AMRESCO公司1);Streptomycin Sulfate(AMRESCO);无水乙醇(淄博亚杜兰经贸有限公司);MTT(Biosharp批号:0793):PBS(实验室自配);
[0048] 1.4实验器材
[0049] 莱卡倒置显微镜(德国Leica型号:DMIL);可见-紫外光微孔板检测仪(美国MD公司型号:SPECTRAMAX190);CO2培养箱(FORMA型号:3111);超净台(苏净集团安泰公司制造型号:SW-CJ-ZFD);纯水仪(美国Sprlng公司型号:S/N020579);精密移液器(法国吉尔森公司型号:P2);电子天平(德国赛多利斯有限公司型号:BT323S);全自动高压灭菌锅(日本SANYO公司型号:MLS-3020);台式电热鼓风干燥箱(上海精密实验设备公司型号:DHG9123A);冰箱(西门子公司型号:KG18V21TI);液氮罐(CBS型号:2001);低速离心机(上海安亭科学仪器厂型号:KA-1000);0.2μm滤器(MILLIPORE型号:SLGP033RB);1cm培养皿(NEST公司)、96孔培养板(NEST公司);细胞计数板;离心管、移液管、Tips若干。
[0050] 2.实验方法
[0051] 1)YAC-1细胞用DMEM+10%FBS于37℃、5%CO2进行常规培养(10cm培养皿),当细胞生长至对数期时,收集细胞,弃去培养液,PBS轻洗3遍,加入3ml0.25%胰蛋白酶-0.04%EDTA,37℃消化2min后,向其中加入5ml完全培养基中和反应,吹打细胞后将其转4
入离心管中,1000rpm离心5min,调整细胞悬液浓度3×10个/ml。
[0052] 2)将细胞种入96孔培养板中,每孔加入细胞悬液180μl,培养板放入细胞培养箱中(37℃,5%CO2)常规培养。
[0053] 3)根据细胞生长情况,一般长至50%-70%,加入益康补元片溶液,继续培养24h。
[0054] 4)24h后加入20μl MTT溶液(5mg/ml,即0.5%MTT),继续培养4h。
[0055] 5)4h后扣板法倒去上清,用吸水纸轻轻拍干,每孔如入200μl二甲基亚砜,置摇床上低速振荡10min,使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪490nm处测量各孔的吸光值。
[0056] 6)同时设置本底(不加细胞,只加培养液),对照孔(细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、二甲基亚砜),每组设定6个复孔。
[0057] 7)结果以药物对细胞的抑制率表示:细胞增值抑制率(%)=(对照孔OD值-给药孔OD值)、对照孔OD值×100%。实验重复3次。
[0058] 3.统计处理
[0059] 采用Microsoft Excel2007软件中的相关分析和Student t检验,数据以mean±S.D.表示。
[0060] 4.实验结果
[0061] MTT法实验后统计结果显示,与对照组比较,当剂量达到5mg/ml时,对YAC-1细胞增殖抑制有差异(P<0.05),剂量在10mg/ml时该差异具有显著性(P<0.01),当剂量达到15-20mg/ml时有极显著性差异(P<0.001)。
[0062] 表1益康补元片对YAC-1细胞增殖抑制影响研究(X±SD)