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一种益康补元片的制备方法及其在抑制小鼠淋巴瘤细胞YAC-1细胞增殖药物中的应用   0    0

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专利申请流程有哪些步骤?
专利申请流程图
申请
申请号:指国家知识产权局受理一件专利申请时给予该专利申请的一个标示号码。唯一性原则。
申请日:提出专利申请之日。
2013-12-11
申请公布
申请公布指发明专利申请经初步审查合格后,自申请日(或优先权日)起18个月期满时的公布或根据申请人的请求提前进行的公布。
申请公布号:专利申请过程中,在尚未取得专利授权之前,国家专利局《专利公报》公开专利时的编号。
申请公布日:申请公开的日期,即在专利公报上予以公开的日期。
2014-04-30
授权
授权指对发明专利申请经实质审查没有发现驳回理由,授予发明专利权;或对实用新型或外观设计专利申请经初步审查没有发现驳回理由,授予实用新型专利权或外观设计专利权。
2015-08-19
预估到期
发明专利权的期限为二十年,实用新型专利权期限为十年,外观设计专利权期限为十五年,均自申请日起计算。专利届满后法律终止保护。
2033-12-11
基本信息
有效性 有效专利 专利类型 发明专利
申请号 CN201310670597.6 申请日 2013-12-11
公开/公告号 CN103690646B 公开/公告日 2015-08-19
授权日 2015-08-19 预估到期日 2033-12-11
申请年 2013年 公开/公告年 2015年
缴费截止日
分类号 A61K36/752A61K9/20A61P35/00 主分类号 A61K36/752
是否联合申请 独立申请 文献类型号 B
独权数量 1 从权数量 6
权利要求数量 7 非专利引证数量 0
引用专利数量 0 被引证专利数量 0
非专利引证
引用专利 被引证专利
专利权维持 8 专利申请国编码 CN
专利事件 转让 事务标签 公开、实质审查、申请权转移、授权、权利转移
申请人信息
申请人 第一申请人
专利权人 徐茂航 当前专利权人 天津睿吉佳德知识产权服务有限公司
发明人 任立杰、王璇、刘海妮 第一发明人 任立杰
地址 山东省青岛市李沧区郑佛路17号 邮编 266000
申请人数量 1 发明人数量 3
申请人所在省 山东省 申请人所在市 山东省青岛市
代理人信息
代理机构
专利代理机构是经省专利管理局审核,国家知识产权局批准设立,可以接受委托人的委托,在委托权限范围内以委托人的名义办理专利申请或其他专利事务的服务机构。
济南舜源专利事务所有限公司 代理人
专利代理师是代理他人进行专利申请和办理其他专利事务,取得一定资格的人。
徐槐
摘要
本发明属于中药技术领域,具体涉及一种益康补元片的制备方法及应用。本发明的益康补元片的制备方法,由黄芪280g、麻罕80g、当归190g、墨旱莲220g、苍术190g、红花150g、赤芍140g、桃仁140g、牛膝150g、川芎120g、枳壳70g、桔梗100g作为原料药制成,采用超临界萃取和微波萃取制备而成,使得芍药苷含量有很大提高。本发明还提供了益康补元片在制备抑制小鼠淋巴瘤细胞YAC-1细胞增殖药物中的应用。
  • 摘要附图
    一种益康补元片的制备方法及其在抑制小鼠淋巴瘤细胞YAC-1细胞增殖药物中的应用
法律状态
序号 法律状态公告日 法律状态 法律状态信息
1 2022-05-13 专利权的转移 登记生效日: 2022.05.06 专利权人由智管家(天津)科技有限公司变更为天津睿吉佳德知识产权服务有限公司 地址由300300 天津市东丽区津塘公路五号桥西800米赢家伟业创业大厦4层4081号变更为300300 天津市东丽区东丽经济技术开发区五纬路58号新濠公寓A座三楼324
2 2015-08-19 授权
3 2015-08-05 专利申请权的转移 登记生效日: 2015.07.17 申请人由山东中大药业有限公司变更为徐茂航 地址由250062 山东省济南市历下区经十路16369号变更为266000 山东省青岛市李沧区郑佛路17号
4 2015-08-05 著录事项变更 发明人由魏书同 段学文变更为任立杰 王璇 刘海妮
5 2014-04-30 实质审查的生效 IPC(主分类): A61K 36/752 专利申请号: 201310670597.6 申请日: 2013.12.11
6 2014-04-02 公开
权利要求
权利要求书是申请文件最核心的部分,是申请人向国家申请保护他的发明创造及划定保护范围的文件。
1.一种益康补元片在制备抑制小鼠淋巴瘤细胞YAC-1细胞增殖药物中的应用,其特征在于,所述益康补元片由黄芪280g、麻罕80g、当归190g、墨旱莲220g、苍术190g、红花
150g、赤芍140g、桃仁140g、牛膝150g、川芎120g、枳壳70g、桔梗100g作为原料药制成,所述益康补元片制备方法由下列步骤组成:取麻罕、当归、苍术、桃仁、川芎,加入到CO2超临界萃取器中,乙醇作为夹带剂,夹带剂占总萃取溶剂的体积百分比为4-6%,萃取压力
15-30MPa,温度30-50℃,CO2流量l-3ml/g生药·min,萃取时间180-220min,得超临界萃取物,备用;取其余中药,粉碎,加入1.6L的50%乙醇,投入微波萃取装置中进行微波萃取,萃取功率600-800W,萃取2次,每次5-10分钟,合并萃取液,浓缩,加到Dl01大孔吸附树脂柱上,50%乙醇洗脱,收集5倍量柱体积洗脱液,减压回收乙醇,浓缩并干燥,得微波提取物,备用;将上述超临界萃取物和微波提取物混合,加入淀粉,70%乙醇制颗粒,干燥,压片,制成
300片,每片重0.3g。

2.根据权利要求l所述的益康补元片在制备抑制小鼠淋巴瘤细胞YAC-1细胞增殖药物中的应用,其特征在于,所述CO2超临界萃取中夹带剂占总萃取溶剂的体积百分比为5%。

3.根据权利要求l所述的益康补元片在制备抑制小鼠淋巴瘤细胞YAC-1细胞增殖药物中的应用,其特征在于,所述CO2超临界萃取中萃取压力为25 MPa。

4.根据权利要求l所述的益康补元片在制备抑制小鼠淋巴瘤细胞YAC-1细胞增殖药物中的应用,其特征在于,所述CO2超临界萃取中CO2流量2ml/g生药·min。

5.根据权利要求l所述的益康补元片在制备抑制小鼠淋巴瘤细胞YAC-1细胞增殖药物中的应用,其特征在于,所述CO2超临界萃取中萃取时间为200min。

6.根据权利要求l所述的益康补元片在制备抑制小鼠淋巴瘤细胞YAC-1细胞增殖药物中的应用,其特征在于,所述微波萃取功率为700W。

7.根据权利要求l所述的益康补元片在制备抑制小鼠淋巴瘤细胞YAC-1细胞增殖药物中的应用,其特征在于,所述微波萃取每次萃取时间为8分钟。
说明书

技术领域

[0001] 本发明属于中药技术领域,具体涉及一种益康补元片的制备方法及其在抑制小鼠淋巴瘤细胞YAC-1细胞增殖药物中的应用。

背景技术

[0002] 益康补元颗粒标准号WS-10983(ZD-0983)-2002,记载于国家中成药标准汇编内科脾胃分册。由黄芪280g、麻罕80g、当归190g、墨旱莲220g、苍术190g、红花150g、赤芍140g、桃仁140g、牛膝150g、川芎120g、枳壳70g、桔梗100g作为原料药制成,具有益气活血,健脾补肾的功效。用于气虚血瘀、脾肾亏虚引起的神疲乏力,呼吸气短,失眠,腰膝酸软,食少健忘等症。
[0003] 现有技术中,尚未有益康补元颗粒在提取制备方面采用超临界和微波技术的报道,而挥发油提取,水煎煮的方法,工艺粗糙、落后,杂质多,导致患者用量过大,不方便服用,严重影响了本品在临床上应用。

发明内容

[0004] 为了解决上述的技术问题,本发明提供了一种益康补元片的制备方法。
[0005] 本发明的另一个目的在于提供一种益康补元片在制备抑制小鼠淋巴瘤细胞YAC-1细胞增殖药物中的应用。
[0006] 本发明的目的是通过如下的方案实现的:
[0007] 一种益康补元片的制备方法,由黄芪280g、麻罕80g、当归190g、墨旱莲220g、苍术190g、红花150g、赤芍140g、桃仁140g、牛膝150g、川芎120g、枳壳70g、桔梗100g作为原料药制成,所述的制备方法由下列步骤组成:取麻罕、当归、苍术、桃仁、川芎,加入到CO2超临界萃取器中,乙醇作为夹带剂,夹带剂占总萃取溶剂的体积百分比为4-6%,萃取压力15-30MPa,温度30-50℃,CO2流量l-3ml/g生药·min,萃取时间180-220min,得超临界萃取物,备用;取其余中药,粉碎,加入1.6L的50%乙醇,投入微波萃取装置中进行微波萃取,萃取功率600-800W,萃取2次,每次5-10分钟,合并萃取液,浓缩,加到Dl01大孔吸附树脂柱上,50%乙醇洗脱,收集5倍量柱体积洗脱液,减压回收乙醇,浓缩并干燥,得微波提取物,备用;将上述超临界萃取物和微波提取物混合,加入淀粉,70%乙醇制颗粒,干燥,压片,制成
300片,每片重0.3g。
[0008] 上述的益康补元片的制备方法中,所述CO2超临界萃取中夹带剂占总萃取溶剂的体积百分比为5%。
[0009] 上述的益康补元片的制备方法中,所述CO2超临界萃取中萃取压力为25MPa。
[0010] 上述的益康补元片的制备方法中,所述CO2超临界萃取中萃取温度为60℃。
[0011] 上述的益康补元片的制备方法中,所述CO2超临界萃取中CO2流量2ml/g生药·min。
[0012] 上述的益康补元片的制备方法中,所述CO2超临界萃取中萃取时间为200min。
[0013] 上述的益康补元片的制备方法中,所述微波萃取功率为700W。
[0014] 上述的益康补元片的制备方法中,所述微波萃取每次萃取时间为8分钟。
[0015] 上述的益康补元片在制备抑制小鼠淋巴瘤细胞YAC-1细胞增殖药物中的应用。
[0016] 现有技术中,益康补元颗粒每次1袋,每袋7g,一日3次。益康补元颗粒服药量大,且颗粒剂制备需要加大量的糖,糖尿病患者不适宜,不加糖的话味道不佳,患者不容易服下,依从性差。采用本发明方法制备成的益康补元片每片重0.3g,每次仅需2片,一日服用3次。在具有更多活性成分的条件下大大减少了服用量。此结论可以通过下述试验证明。且制备成片剂,患者随水吞下即可,服药量小且无苦味,患者易于接受。
[0017] 试验一、不同方法制备的益康补元片中芍药苷含量的比较
[0018] l、仪器及试药本发明益康补元片:按实施例1方法制备,使用1510g原料药,经提取制成300片,每片重0.3g。原益康补元颗粒,按照WS-10983(ZD-0983)-2002标准方法制备。Agilent1200高效液相色谱仪;METTLER AE240电子分析天平;芍药苷对照品(中国药品生物制品检定所)。
[0019] 2、方法
[0020] 照高效液相色谱法(中国药典2010年版一部附录V D)测定。
[0021] 色谱条件与系统适用性试验用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂;乙腈-0.2%磷酸水溶液(15∶85)为流动相;检测波长为230nm。理论板数按芍药苷峰计算应不低于3000。
[0022] 对照品溶液的制备取经五氧化二磷减压干燥36小时的芍药苷对照品适量,精密称定,加甲醇制成每1ml含0.1mg的溶液,即得。
[0023] 本发明产品供试品溶液的制备取本发明的益康补元片,研细,取2.25g,精密称定,置具塞锥形瓶中,精密加入甲醇25ml.密塞,称定重量,超声处理(功率250w.频率33kHz)1小时,放冷,再称定重量,用甲醇补足减失的重量,摇匀,滤过,用微孔滤膜(0.45μm)滤过,即得。
[0024] 对照产品供试品溶液的制备取本对照的益康补元颗粒,研细,取2.5g,精密称定,置具塞锥形瓶中,精密加入甲醇25ml.密塞,称定重量,超声处理(功率250w.频率33kHz)1小时,放冷,再称定重量,用甲醇补足减失的重量,摇匀,滤过,用微孔滤膜(0.45μm)滤过,即得。
[0025] 测定法分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μL,注入液相色谱仪,测定,即得。
[0026] 3、结果
[0027] 结果表明,本发明益康补元片中芍药苷的含量为5-8mg/片;而原益康补元颗粒中芍药苷的含量为4.8mg/袋,每次服用量2片的芍药苷含量为原颗粒剂含量的2-4倍,在服用量减少的情况下,芍药苷含量有很大提高。
[0028] 上述研究表明,采用本发明制备方法制备的益康补元片,有效成分含量远远高于WS-10983(ZD-0983)-2002标准记载的方法制备的益康补元颗粒。

实施方案

[0029] 下面结合具体实施例对本发明作更进一步的说明,以便本领域的技术人员更了解本发明,但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例,凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
[0030] 实施例1
[0031] 取黄芪280g、麻罕80g、当归190g、墨旱莲220g、苍术190g、红花150g、赤芍140g、桃仁140g、牛膝150g、川芎120g、枳壳70g、桔梗100g,将麻罕、当归、苍术、桃仁、川芎加入到CO2超临界萃取器中,乙醇作为夹带剂,夹带剂占总萃取溶剂的体积百分比为5%,萃取压力25MPa,温度40℃,CO2流量2ml/g生药·min,萃取时间200min,得超临界萃取物,备用;取其余中药,粉碎,加入1.6L的50%乙醇,投入微波萃取装置中进行微波萃取,萃取功率700W,萃取2次,每次8分钟,合并萃取液,浓缩,加到Dl01大孔吸附树脂柱上,50%乙醇洗脱,收集5倍量柱体积洗脱液,减压回收乙醇,浓缩并干燥,得微波提取物,备用;将上述超临界萃取物和微波提取物混合,加入淀粉,70%乙醇制颗粒,干燥,压片,制成300片,每片重0.3g。
[0032] 经检测,成品中芍药苷的含量为7.8mg/片。
[0033] 实施例2
[0034] 取黄芪280g、麻罕80g、当归190g、墨旱莲220g、苍术190g、红花150g、赤芍140g、桃仁140g、牛膝150g、川芎120g、枳壳70g、桔梗100g,将麻罕、当归、苍术、桃仁、川芎加入到CO2超临界萃取器中,乙醇作为夹带剂,夹带剂占总萃取溶剂的体积百分比为4%,萃取压力30MPa,温度50℃,CO2流量3ml/g生药·min,萃取时间180min,得超临界萃取物,备用;取其余中药,粉碎,加入1.6L的50%乙醇,投入微波萃取装置中进行微波萃取,萃取功率600W,萃取2次,每次5分钟,合并萃取液,浓缩,加到Dl01大孔吸附树脂柱上,50%乙醇洗脱,收集5倍量柱体积洗脱液,减压回收乙醇,浓缩并干燥,得微波提取物,备用;将上述超临界萃取物和微波提取物混合,加入淀粉,70%乙醇制颗粒,干燥,压片,制成300片,每片重0.3g。
[0035] 经检测,成品中芍药苷的含量为5.6mg/片。
[0036] 实施例3
[0037] 取黄芪280g、麻罕80g、当归190g、墨旱莲220g、苍术190g、红花150g、赤芍140g、桃仁140g、牛膝150g、川芎120g、枳壳70g、桔梗100g,将麻罕、当归、苍术、桃仁、川芎加入到CO2超临界萃取器中,乙醇作为夹带剂,夹带剂占总萃取溶剂的体积百分比为6%,萃取压力15MPa,温度30℃,CO2流量1ml/g生药·min,萃取时间220min,得超临界萃取物,备用;取其余中药,粉碎,加入1.6L的50%乙醇,投入微波萃取装置中进行微波萃取,萃取功率800W,萃取2次,每次10分钟,合并萃取液,浓缩,加到Dl01大孔吸附树脂柱上,50%乙醇洗脱,收集5倍量柱体积洗脱液,减压回收乙醇,浓缩并干燥,得微波提取物,备用;将上述超临界萃取物和微波提取物混合,加入淀粉,70%乙醇制颗粒,干燥,压片,制成300片,每片重0.3g。
[0038] 经检测,成品中芍药苷的含量为6.2mg/片。
[0039] 实施例4:益康补元片抑制小鼠淋巴瘤细胞YAC-1细胞增殖的实验研究资料[0040] 1.实验材料
[0041] 1.1实验用细胞株
[0042] 小鼠淋巴瘤细胞YAC-1细胞,山东大学实验室细胞库,DMEM+10%FBS常规培养。
[0043] 1.2实验药物
[0044] 研究药物:本发明益康补元片:按实施例1方法制备。
[0045] 药液储液:称取100mg益康补元片,溶于5ml无水乙醇中,0.2μm滤器过滤,500μldoff管分装,-20℃存储,同时0.2μm滤器过滤无水乙醇以备对照组之用。
[0046] 1.3实验试剂
[0047] DMEM(GIBCO公司Cat.No.12100-061Lot.No.758137);胎牛血清(浙江天杭生物科技有限公司Lot.No.100419);NaHCO3(上海久亿化学试剂有限公司Cat.No.11810-033Lot.No.1088387);Trypsin(AMRESCO公司);EDTA(AMRESCO公司);Penicillin G Sodium Salt(AMRESCO公司1);Streptomycin Sulfate(AMRESCO);无水乙醇(淄博亚杜兰经贸有限公司);MTT(Biosharp批号:0793):PBS(实验室自配);
[0048] 1.4实验器材
[0049] 莱卡倒置显微镜(德国Leica型号:DMIL);可见-紫外光微孔板检测仪(美国MD公司型号:SPECTRAMAX190);CO2培养箱(FORMA型号:3111);超净台(苏净集团安泰公司制造型号:SW-CJ-ZFD);纯水仪(美国Sprlng公司型号:S/N020579);精密移液器(法国吉尔森公司型号:P2);电子天平(德国赛多利斯有限公司型号:BT323S);全自动高压灭菌锅(日本SANYO公司型号:MLS-3020);台式电热鼓风干燥箱(上海精密实验设备公司型号:DHG9123A);冰箱(西门子公司型号:KG18V21TI);液氮罐(CBS型号:2001);低速离心机(上海安亭科学仪器厂型号:KA-1000);0.2μm滤器(MILLIPORE型号:SLGP033RB);1cm培养皿(NEST公司)、96孔培养板(NEST公司);细胞计数板;离心管、移液管、Tips若干。
[0050] 2.实验方法
[0051] 1)YAC-1细胞用DMEM+10%FBS于37℃、5%CO2进行常规培养(10cm培养皿),当细胞生长至对数期时,收集细胞,弃去培养液,PBS轻洗3遍,加入3ml0.25%胰蛋白酶-0.04%EDTA,37℃消化2min后,向其中加入5ml完全培养基中和反应,吹打细胞后将其转4
入离心管中,1000rpm离心5min,调整细胞悬液浓度3×10个/ml。
[0052] 2)将细胞种入96孔培养板中,每孔加入细胞悬液180μl,培养板放入细胞培养箱中(37℃,5%CO2)常规培养。
[0053] 3)根据细胞生长情况,一般长至50%-70%,加入益康补元片溶液,继续培养24h。
[0054] 4)24h后加入20μl MTT溶液(5mg/ml,即0.5%MTT),继续培养4h。
[0055] 5)4h后扣板法倒去上清,用吸水纸轻轻拍干,每孔如入200μl二甲基亚砜,置摇床上低速振荡10min,使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪490nm处测量各孔的吸光值。
[0056] 6)同时设置本底(不加细胞,只加培养液),对照孔(细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、二甲基亚砜),每组设定6个复孔。
[0057] 7)结果以药物对细胞的抑制率表示:细胞增值抑制率(%)=(对照孔OD值-给药孔OD值)、对照孔OD值×100%。实验重复3次。
[0058] 3.统计处理
[0059] 采用Microsoft Excel2007软件中的相关分析和Student t检验,数据以mean±S.D.表示。
[0060] 4.实验结果
[0061] MTT法实验后统计结果显示,与对照组比较,当剂量达到5mg/ml时,对YAC-1细胞增殖抑制有差异(P<0.05),剂量在10mg/ml时该差异具有显著性(P<0.01),当剂量达到15-20mg/ml时有极显著性差异(P<0.001)。
[0062] 表1益康补元片对YAC-1细胞增殖抑制影响研究(X±SD)
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