羧酸酯酶基因、重组质粒、重组工程菌及编码蛋白和应用   0    0

[0001] 本发明涉及生物工程领域，特别涉及一种耐热羧酸酯酶基因、重组质粒、重组工程菌及其编码蛋白和在农药降解中的应用。

[0002] 羧酸酯酶(EC 3.1.1.3,carboxyl ester hydrolases)是一大类偏好于催化酰基链长度小的底物(≤10)的酯键水解和形成的酶类，该酶具有优良的化学选择性、区域选择性和立体选择性，可以应用于农药降解、环境治理以及医药合成等领域。有机磷类农药一直在农业生产中被广泛使用，但也带来诸如环境污染、农药残留等问题。与传统化学法降解农药相比，羧酸酯酶可以专一性的催化有机磷农药中的酯键断裂，继而生成无毒或低毒的醇或酸，是一种绿色高效的降解方式。变铅青链霉菌(Streptomyces lividands)TK24属于放线菌目链霉菌科链霉菌属，具有丰富的次级代谢多样性，可产生包括酯酶在内的多种水解酶类。链霉菌蛋白表达常需要糖基化等蛋白质翻译后修饰过程，故在大肠杆菌 (Escherichia coli)中进行异源表达时，由于大肠杆菌表达系统缺乏完善的蛋白质翻译后修饰系统，且变铅青链霉菌TK24基因组序列G+C含量高达72.2％，导致来自链霉菌的蛋白在大肠杆菌中常无法表达或以包涵体形式存在，极少获得具活性的功能蛋白。由于链霉菌基因组的高GC含量，使得变铅青链霉菌TK24 染色体上的基因座SLIV_RS20080无法在大肠杆菌中获得异源表达。

[0003] 为了解决上述技术问题，本发明对编码该酯酶基因的核苷酸序列进行优化，并成功获得异源表达，得到了一种新的羧酸酯酶基因。本发明的酯酶基因与原酯酶基因相比，其核苷酸序列所编码的氨基酸保持不变，但906个核苷酸序列中174个发生变化，占整个基因的19.2％。GC含量也由原来的77.4％下降至68.2％。本发明将基因座(Locus tag)SLIV_RS20080编码的酯酶基因命名为estC，优化后的酯酶基因命名为estC'。由于优化前后该酯酶基因氨基酸组成相同，故将其编码的酯酶统一命名为EstC。

[0004] 本发明还提供了一种重组质粒、重组工程菌及其编码蛋白和应用。

[0005] 本发明的一种耐热羧酸酯酶基因estC'，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1 所示。

[0006] 本发明的一种重组质粒，其包含以上所述的耐热羧酸酯酶基因estC'。

[0007] 优选所述的重组质粒的表达载体为pET28b-estC'。

[0008] 本发明的一种耐热酯酶基因重组工程菌，其包含上述所述的重组质粒。

[0009] 该重组工程菌为Rosetta(DE3)pLysS/pET28b-estC'。

[0010] 优选该工程菌的表达耐热酯酶基因的编码蛋白的条件为：IPTG的诱导浓度为0.01-0.5mM，诱导表达温度为16-25℃。

[0011] 本发明所述的耐热酯酶基因的编码蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2 所示。其由上述所述的耐热羧酸酯酶基因estC'编码。

[0012] 优选该编码蛋白的最适反应温度为55℃，最适反应的pH值是9.0。

[0013] 优选所述的耐热酯酶基因的编码蛋白，其在100℃下放置6h时酶活仍在 80％以上。

[0014] 本发明所述的耐热酯酶基因的编码蛋白在农药降解及环境治理中的应用。

[0015] 优选所述的耐热酯酶基因的编码蛋白在有机磷类农药降解中的应用。

[0016] 有益效果

[0017] 本发明将羧酸酯酶基因estC'与pET28b质粒相连接，成功构建具卡那霉素 (Kanamycin,Kan)抗性的重组表达载体pET28b-estC'，并将该重组质粒转化大肠杆菌感受态细胞Rosetta(DE3)，成功构建重组工程菌 Rosetta(DE3)pLysS/pET28b-estC'，该重组工程菌同时具备卡那霉素和氯霉素 (Chloramphenicol,Cam)抗性。

[0018] 本发明通过该基因重组工程菌Rosetta(DE3)pLysS/pET28b-estC'在低温和适量异丙基硫代半乳糖苷(isopropyl-β-D-thiogalac topyranoside，IPTG)诱导的条件下在大肠杆菌中成功获得异源表达。

[0019] 本发明采用Co2+离子亲和层析法获得高度纯化羧酸酯酶蛋白EstC，并通过SDS–PAGE电泳鉴定。本发明采用对硝基苯酚法鉴定酯酶EstC的酶学性质。 EstC最适反应温度为55℃，最适反应pH是9.0(Tris-HCl buffer)，在55℃温育 180h后酶活性无明显变化，100℃下温育6h，酶活仍在80％以上，表明其具有高度热稳定性。以对硝基苯酚丁酸酯pNPB4(p-nitropHenyl butyrate)为底物，该酶在25℃，pH 9.0条件下比活力为84.91U/mg。

[0020] 本发明采用对硝基苯酚法研究了金属离子、抑制剂、去垢剂和有机溶剂对酯酶EstC酶活的影响。结果表明对于金属离子和抑制剂，1mM的Cr3+对酶有较强的激活效应，可使酶活提高26.25％，但10mM的Cr3+却在一定程度上抑制酶活，使酶活下降至68.19％；10mM的Fe2+、Co2+、Hg2+、Ni2+强烈抑制酶活，使酶活分别降至28.61％、19.04％、13.26％、7.95％；1mM的EDTA对酯酶酶活基本无影响，但随着浓度增加至10mM时，可在一定程度上抑制酶活，使酶活降低至79.08％；1mM的PMSF对酶活有一定的抑制作用，且随着PMSF 浓度的上升，其对酯酶酶活的抑制作用也相应增强，10mM的PMSF使酶活降低至56.52％。对于去垢剂，1％的SDS对酶活有强烈的抑制作用，可使酶活降至20.52％。对于有机溶剂，15％的乙腈对酯酶酶活无明显影响，但随着浓度的上升，30％的乙腈能对酯酶酶活产生强烈的抑制作用，使酶活下降至32.28％； 15％和30％的异丙醇均对酶活有较强的抑制作用，且随其有机溶剂浓度的增加抑制酶活作用也增强。

[0021] 本发明所获羧酸酯酶EstC能水解有机磷类农药，且由于羧酸酯酶EstC的高度热稳定性，能在较高温度下维持自身活力，0.5U的酯酶EstC在45℃反应 14h可以降解80％以上的有机磷类农药。

[0031] 下面结合说明书附图介绍本发明的较佳实施例，举例证明本发明可以实施，通过向本领域中的技术人员完整介绍本发明，使其技术内容更加清楚和便于理解。本发明可以通过许多不同形式的实施例来得以体现，其保护范围并非仅限于文中提到的实施例，本文的附图和说明本质上是举例说明而不是限制本发明。

[0032] 下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

[0033] 下述实施例中所用的原材料、试剂和设备等，如无特殊说明，均可从商业途径得到或已公开。

[0034] 下面结合实施例对本发明做详细的说明。

[0035] 实施例1

[0036] 羧酸酯酶基因estC的优化、合成与序列分析

[0037] 变铅青链霉菌TK24基因座(Locus tag)SLIV_RS20080即酯酶基因estC，该段核苷酸序列所编码的蛋白质名称为α/β水解酶(alpha/beta hydrolase)，即羧酸酯酶，蛋白质产物(Protein product)编号(Accession)为WP_003975294，在 GenBank中的蛋白质登录号为AIJ14960。变铅青链霉菌TK24酯酶基因estC 在染色体上的核苷酸序列起始位点(Start)为4442794，终止位点(Stop)为 4443699，长度为906bp，其中A碱基96个，占比10.6％；T碱基
109个，占比12％；C碱基338个，占比37.3％；G碱基363个，占比40.1％；GC含量较高，为
77.4％。由于酯酶基因estC的高GC含量和链霉菌复杂的蛋白质翻译后修饰过程，使得该基因在大肠杆菌中的异源表达出现障碍。

[0038] 为使酯酶基因estC在大肠杆菌中实现异源表达，本发明对该段基因相对应的核苷酸序列进行优化，降低GC含量，同时为提高蛋白表达成功率，以大肠杆菌偏爱密码子代替稀有密码子，成功实现酯酶在大肠杆菌中的异源表达。优化后的酯酶基因estC'核苷酸序列全长保持不变，所编码的氨基酸序列也保持不变，但906个碱基中共有174个发生变化，优化后的基因核苷酸序列中包含A碱基105 个，占比11.6％；T碱基183个，占比20.2％；C碱基239个，占比26.4％；G碱基379 个，占比41.8％；GC含量也由原来的77.4％下降至68.2％，克服了GC含量过高导致该酯酶无法表达的缺陷，为优化后的酯酶基因est C'在大肠杆菌中实现异源表达提供了保障。酯酶基因estC与优化后的estC'的序列比对见图1。

[0039] 实施例2

[0040] 构建重组质粒及重组工程菌

[0041] 将人工合成的优化后的羧酸酯酶基因estC'与携带有Kan抗性基因的质粒表达载体pET28b相连接，得到重组质粒pET28b-est C'。连接条件为16℃反应过夜，连接体系为：

[0042]

[0043] 将上述的10μL连接反应液与100μLE.coli Rosetta(DE3)感受态细胞混合，冰浴30min，42℃条件下热击90s后立即冰浴5min，加入500μL LB培养基恢复培养1h，构建重组工程菌Rosetta(DE3)pLysS/pET28b-estC'，该工程菌具有Kan和Cam抗性，可通过具Kan和Cam抗性的LB培养基筛选。

[0044] 实施例3

[0045] 羧酸酯酶EstC的表达

[0046] 从上述转化成功的平板上挑取重组工程菌，随后接种于装有5mL LB液体培养基的试管中，37℃，225rpm过夜振荡培养；再以1:100接种于含100mL LB 液体培养基的锥形瓶中，37℃，225rpm振荡培养。期间观察菌体生长情况，培养至OD600为0.4-0.6时加入终浓度为0.01-0.5mM的IPTG，180rpm， 16℃-25℃低温振荡，诱导表达20-24h。其后4℃，5000rpm离心
5min收集菌体，超声波破碎，得到羧酸酯酶EstC。

[0047] 实施例4

[0048] 羧酸酯酶EstC的纯化及蛋白浓度测定

[0049] 上述的羧酸酯酶基因estC'所编码的蛋白EstC氨基酸序列如SEQ ID NO: 2所示。对其进行氨基酸序列分析表明，酯酶EstC由301个氨基酸组成，理论分子量
(MolecularWeight)约为31.084kDa，由于pET-28b带有两个His标签，故表达出来的蛋白大小会比理论计算值稍大一些。用Co2+亲和层析进行纯化，并用12％SDS-PAGE检测目的蛋白在大肠杆菌中的表达(图2)，由图2可见：该蛋白在对应36kDa处有一特异性很高的条带，表明该蛋白在大肠杆菌中成功实现异源表达，并通过Co2+亲和层析得到了纯度较高的目的蛋白，使用 Bradford蛋白试剂盒测定蛋白浓度为0.234mg/mL。

[0050] 实施例5

[0051] 羧酸酯酶EstC酶学性质检测

[0052] 以对硝基苯酚法检测酯酶EstC酶活，酶活单位(U)定义为25℃条件下每分钟水解对硝基苯酚酯产生1μmol对硝基苯酚所需的酶量。酶比活力单位是 U/mg，表示每毫克酶蛋白所具有的酶活力。标准检测反应体系为1mL，其中 980μL缓冲液，10μL 0.5mM的对硝基苯酚酯，10μL酶液，在25℃条件下反应5min，使用可见分光光度计，410nm下检测吸光值，以不加酶的混合液作为对照。EstC酶活可通过对硝基苯酚标准曲线计算得出。

[0053] (1)羧酸酯酶EstC最适pH检测

[0054] 采用标准反应体系，在相应的pH范围使用相应的缓冲液，pH 5.0-7.0，50 mM Na-Citrate buffer；pH 7.0-9.0，50mM Tris-HCl buffer；pH 9.0-10.5，50mM K2HPO4-KOH buffer。实验独立重复3次，测量值为三个独立实验数据平均值。结果显示该酶的最适pH是9.0(Tris-HCl buffer)(图3)。

[0055] (2)羧酸酯酶EstC最适温度检测

[0056] 采用标准反应体系，实验选取50mM Tris-HCl缓冲液(pH 9.0)，测定温度为10℃-65℃下酯酶EstC的活性，以测得最适温度下的最大酶活为100％。实验独立重复三次，取平均值。结果显示该酶的最适温度是55℃(图4)。

[0057] (3)羧酸酯酶EstC最适底物测定

[0058] 采用标准反应体系，在25℃，pH 9.0条件下，选取不同碳链长度(C4-C16) 对硝基苯酚酯为底物检测酯酶EstC酶活。结果显示当底物为对硝基苯酚丁酸酯(pNPB4)时酶的比活力最高，达84.91U/mg(表1)。

[0059] 表1酯酶EstC的比活力

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[0061] (4)羧酸酯酶EstC热稳定性检测

[0062] 纯化后的羧酸酯酶EstC分别放置于55℃和100℃温育一定时间后，采用标准检测体系，25℃条件下检测残余酶活力，未处理的酶活性定义为100％。结果表明，酯酶EstC在55℃放置180h后酶活性无明显变化(图5)；100℃下温育6h，酶活仍在80％以上，表明其具有高度热稳定性(图6)。

[0063] (5)金属离子和抑制剂对羧酸酯酶EstC酶活的影响

[0064] 采用标准反应体系，在25℃，pH 9.0条件下，检测金属离子和抑制剂对酯酶EstC催化活力的影响(表2)。1mM的Cr3+对酯酶酶活有一定程度的激活作用，但随着浓度的升高，10mM的Cr3+则对酯酶酶活有较强的抑制作用，使酶活降至68.19％；1mM的K+、Zn2+、Mn2+、Mg2+、Fe2+和Cu2+对酯酶酶活基本无影响，除K+和Zn2+随浓度增加对酯酶酶活产生激活效应之外，Mn2+、Mg2+、 Fe2+和Cu2+均随离子浓度上升而抑制酶活，尤其是10mM的Fe2+能产生强烈的抑制作用，可使酶活降至28.61％；1mM的Al3+、Na+、Ca2+、Fe3+对酯酶酶活有较轻微的抑制作用，且随着离子浓度的上升抑制作用越强，10mM的Al3+、 Na+、Ca2+、Fe3+可使酶活分别降至
50.44％、85.87％、82.36％和52.14％；1mM 的Hg2+和Co2+也对酯酶酶活有较强的抑制作用且随离子浓度上升抑制作用越强，10mM的Hg2+和Co2+使酶活分别降至13.26％和19.04％；
1mM的Ni2+强烈抑制酯酶酶活，当浓度上升至10mM时，酯酶酶活降至7.95％；1mM的 EDTA和PMSF均在一定程度上抑制酶活且都随浓度上升抑制作用越显著。

[0065] 表2金属离子和抑制剂对EstC活性的影响

[0066]

[0067]

[0068] 5.5.6去垢剂对羧酸酯酶EstC酶活的影响

[0069] 采用标准反应体系，在25℃，pH 9.0条件下，检测去垢剂对酯酶EstC催化活力的影响(表3)。在所有被检测的去垢剂中，浓度为0.1％的CTAB、Tween-20 以及Triton X-100对酯酶酶活均无明显影响，但当浓度达到1％时，会对酯酶酶活产生较强的抑制作用，使酶活分别降至59.34％、75.11％和50.87％；浓度为1％的Tween-80对酶活的抑制作用相对于浓度为0.1％时无显著变化，相对酶活为79.16％；浓度为0.1％的SDS能对酯酶EstC产生较强烈的抑制作用，且随其浓度的增加抑制酶活作用增强。

[0070] 表3去垢剂对EstC活性的影响

[0071]

[0072] 5.5.7有机溶剂对羧酸酯酶EstC酶活的影响

[0073] 采用标准反应体系，在25℃，pH 9.0条件下，检测有机溶剂对酯酶EstC催化活力的影响(表4)。在所有被检测的浓度为15％的有机溶剂中，除乙腈对酶活无明显影响外，其他几种有机溶剂均对酶活产生一定的抑制作用，其中浓度为15％的甲醇强烈抑制酶活，使酶活降至36.81％；浓度为30％的有机溶剂中，乙腈、DMF、乙醇、异丙醇、甲醇均对酯酶酶活产生强烈的抑制作用，使酶活分别降至32.28％、45.45％、30.78％、32.54％和8.06％。

[0074] 表4有机溶剂对EstC活性的影响

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[0077] 5.5.8羧酸酯酶EstC对农药的降解

[0078] 为探究酯酶EstC在农药降解方面的应用，采用高效液相色谱法检测该酶对有机磷类农药的降解效力。取0.5U的纯化酯酶与终浓度为65mg/L的有机磷类农药毒死蜱加入到浓度为50mM、pH值为9.0的Tris-HCl缓冲液中，反应总体系1mL，以不加酶的同样处理作为空白对照，45℃水浴反应，并在反应2h、4h、6h、8h、10h以及14h时分别取样，反应液加入氯化钠使其饱和，然后加入同等体积的乙酸乙酯进行化合物萃取，充分振荡混匀后12000rpm 离心十分钟，抽取上层有机相，用0.22μm的有机膜过滤去除杂质，液相色谱测定。反应结果表明，0.5U的酯酶EstC在45℃反应14h可以降解80％的有机磷农药(图7)，体现了该酶在农药降解方面的良好的应用前景。

[0079] 6 SEQ ID NO:1优化后的变铅青链霉菌TK24羧酸酯酶estC'基因序列 ATGCCGGATGCGGCGGCGGAGCCGGGTACCGCGGCGGCGCGTGATGCGG CGGAGGAAAAGAGCGCGCTGAGCCATCCGGCGGTTGAACCGGACAGCA CCGCGGGTTATGGTGACCACCCGGATCAGGTGATCGATTTCTATCTGCCG CGTGGTGGCGCGGGTCCGGGTGAAGCGGCGCCGGTGGTTGTTGTTCTGC ATGGTGGCAGCTGGCGTGCGCCGTACGACCGTCGTCACATTAGCCCGTTC GCGGGTTTTCTGGCGCGTCGTGGCTTCGCGGTGGCGAGCGTTGAGTATCG TCGTGGTGCGGAGGGTCCGGGTGCGGAGGGTGCGGGTGACGATCCGGT GGCGGGCCGTTGGCCGGACACCTTTGACGATGTTGCGGCGGCGCTGGAT GCGCTGCCGGAACTGGTTCGTCAGCACCTGCCGCGTGCGGATGCGCGTC GTGTGGTTCTGACCGGTCACAGCGCGGGTGGCCACCTGGCGCTGTGGGC GGCGGCGCGTCACCTGCTGCCGGCGGACGCGCCGTGGCTGACCGATCGT CCGGCGCCGCTGCGTGGTGTGGTTGCGCTGGCGCCGATTGCGGACTTTG AGGTGGCGGATCGTCTGGGCGTTTGCGGTGGCGCGGCGCGTCAACTGCT GGGTGACGGCGAACTGTTTGCGGGTCGTCGTCCGTACGCGGATCCGGCG CTGCTGCTGCCGACCGGTATTGCGACCACCCTGGTTCAGGGTCGTGCGGA TGTGGATGTTCCGCAAGCGGTGGCGGAAGCGTACGCGGATGCGGCGGCG AAAGCGGGTGAGGTGGTTGGCGTGACCCTGCTGGAAGATGTTGGTCATT  ATCCGCTGATTGACCCGGCGGCGGATGCGTGCGCGGTGGTTGCGGAGGA AATTGCGCAACTGGCGTGGTAA

[0080] 7 SEQ ID NO:2变铅青链霉菌TK24羧酸酯酶EstC氨基酸序列 MPDAAAEPGTAAARDAAEEKSALSHPAVEPDSTAGYGDHPDQVIDFYLPRG GAGPGEAAPVVVVLHGGSWRAPYDRRHISPFAGFLARRGFAVASVEYRRG AEGPGAEGAGDDPVAGRWPDTFDDVAAALDALPELVRQHLPRADARRVVL TGHSAGGHLALWAAARHLLPADAPWLTDRPAPLRGVVALAPIADFEVADRL GVCGGAARQLLGDGELFAGRRPYADPALLLPTGIATTLVQGRADVDVPQAV AEAYADAAAKAGEVVGVTLLEDVGHYPLIDPAADACAVVAEEIAQLAW。

[0022] 图1羧酸酯酶基因estC与优化后的estC'的序列比对图

[0023] 图2 SDS–PAGE分析EstC的表达

[0024] 其中M为蛋白质Marker；1为IPTG诱导的细胞破碎液；2为IPTG诱导的粗酶液；3为纯化的EstC蛋白。

[0025] 图3 EstC的最适反应pH值的示意图

[0026] ▲为Na-Citrate(pH 5.0–7.0)；■为Tris-HCl(7.0–9.0)；●为KH2PO4-KOH (9.0–10.5)。

[0027] 图4 EstC的最适温度的示意图

[0028] 图5 EstC在55℃下的热稳定性示意图

[0029] 图6 EstC在100℃下的热稳定性示意图

[0030] 图7 EstC对有机磷农药的降解示意图