[0020] 本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的产品及方法已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的产品及方法进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明进行详细说明。
[0021] 实施例1蛋白核小球藻细胞利用木薯渣为主要原料制备油脂的方法，其包括如下步骤：
将里氏木霉划线接种在PDA培养基上培养，得到单菌落；挑取单菌落接种到一级种子培养基进行培养，然后进行二级种子培养基培养，获得里氏木霉种子液；所述一级种子培养基和二级种子培养基均为PDA液体培养基；
挑取蛋白核小球藻，种到含有生长培养基的容器中，光照强度6000lux，28℃培养，每天摇动容器2-3次，待生长至对数生长期，得到蛋白核小球藻液；所述生长培养基的组分为：葡萄糖10g/L，氯化铵 2g/L，硝酸钠 1g/L，磷酸二氢钾 0.5g/L，氯化钠 0.1g/L，七水硫酸镁
100mg/L，氯化钙30mg/L，柠檬酸铁铵20mg/L，七水硫酸锌10mg/L，硫酸锰10mg/L；
将黑曲霉划线接种在斜面培养基上培养，得到单菌落；挑取单菌落接种到一级种子培养基进行培养，然后进行二级种子培养基培养，获得黑曲霉种子液；所述斜面培养基组分为：马铃薯150g/L，蔗糖20g/L，琼脂15g/L；所述一级种子培养基和二级种子培养基的组分均为：玉米粉50g/L，蔗糖10g/L，硫酸铵5g/L，磷酸二氢钾1g/L，磷酸氢二钾1g/L。
[0022] 将处于对数生长期的蛋白核小球藻液和里氏木霉种子液接种到含有培养基的反应池中，蛋白核小球藻和里氏木霉的接种密度分别为1×106个/ml和1×107cfu/ml，温度为28℃，24小时持续光照，强度为6000Lux，转速为100rpm，发酵时间为3天，然后接入黑曲霉种子液，接种密度为5×107cfu/ml，继续培养3天，培养结束后，经过离心、洗涤和冷冻干燥后，即得到粉末；所述培养基的具体组成如下：木薯渣50g/L，硝酸钠 1g/L，磷酸二氢钾 0.5g/L，氯化钠 0.1g/L，七水硫酸镁 100mg/L，氯化钙50mg/L，柠檬酸铁铵20mg/L，七水硫酸锌
10mg/L。
[0023] 将粉末采用脉冲电场处理，电场强度20kV/cm，脉冲宽度4us，处理时间200us，然后将粉末添加到氯仿甲醇混合溶液（氯仿与甲醇的体积比为2:1）中，添加量为1g粉末：2ml氯仿甲醇混合溶液，超声提取，提取温度为60℃，超声功率为200W，提取时间为60min，然后离心，收集氯仿相，置于氮气中吹干，并且真空干燥，得到油脂；油脂、脂肪酶（1万U/g）以及甲醇按照5ml：1g：6ml的体积比添加到反应器中，催化反应
12小时，然后添加占油脂两倍体积的甲醇，继续催化反应20h，终止反应，催化反应在控温为
45℃的摇床中进行，摇床转速为100rpm；将反应体系的混合物离心10分钟，12000rpm，将上层液相部分移出，静置分层；取出静置分层后的下层液相，即为生物柴油粗品，再次离心10分钟，12000rpm，取出上层液相，加入2倍体积50℃的超纯水，充分搅动均匀，再次离心10分钟，12000rpm， 静置分层后得到的上层有机相，分离、取出上层有机相，即得生物柴油。
[0024] 实施例2蛋白核小球藻细胞利用木薯渣为主要原料制备油脂的方法，其包括如下步骤：
将里氏木霉划线接种在PDA培养基上培养，得到单菌落；挑取单菌落接种到一级种子培养基进行培养，然后进行二级种子培养基培养，获得里氏木霉种子液；所述一级种子培养基和二级种子培养基均为PDA液体培养基；
挑取蛋白核小球藻，种到含有生长培养基的容器中，光照强度6000lux，28℃培养，每天摇动容器2-3次，待生长至对数生长期，得到蛋白核小球藻液；所述生长培养基的组分为：葡萄糖10g/L，氯化铵 2g/L，硝酸钠 1g/L，磷酸二氢钾 0.5g/L，氯化钠 0.1g/L，七水硫酸镁
100mg/L，氯化钙30mg/L，柠檬酸铁铵20mg/L，七水硫酸锌10mg/L，硫酸锰10mg/L；
将黑曲霉划线接种在斜面培养基上培养，得到单菌落；挑取单菌落接种到一级种子培养基进行培养，然后进行二级种子培养基培养，获得黑曲霉种子液；所述斜面培养基组分为：马铃薯150g/L，蔗糖20g/L，琼脂15g/L；所述一级种子培养基和二级种子培养基的组分均为：玉米粉50g/L，蔗糖10g/L，硫酸铵5g/L，磷酸二氢钾1g/L，磷酸氢二钾1g/L。
[0025] 将处于对数生长期的蛋白核小球藻液和里氏木霉种子液接种到含有培养基的反应池中，蛋白核小球藻和里氏木霉的接种密度分别为1×106个/ml和1×107cfu/ml，温度为28℃，24小时持续光照，强度为7000Lux，转速为100rpm，发酵时间为3天，然后接入黑曲霉种子液，接种密度为5×107cfu/ml，继续培养4天，培养结束后，经过离心、洗涤和冷冻干燥后，即得到粉末；所述培养基的具体组成如下：木薯渣80g/L，硝酸钠 2g/L，磷酸二氢钾 1g/L，氯化钠 0.2g/L，七水硫酸镁 200mg/L，氯化钙70mg/L，柠檬酸铁铵30mg/L，七水硫酸锌
15mg/L。
[0026] 将粉末采用脉冲电场处理，电场强度20kV/cm，脉冲宽度4us，处理时间200us，然后将粉末添加到氯仿甲醇混合溶液（氯仿与甲醇的体积比为2:1）中，添加量为1g粉末：2ml氯仿甲醇混合溶液，超声提取，提取温度为65℃，超声功率为100W，提取时间为90min，然后离心，收集氯仿相，置于氮气中吹干，并且真空干燥，得到油脂；油脂、脂肪酶（1万U/g）以及甲醇按照5ml：1g：6ml的体积比添加到反应器中，催化反应
12小时，然后添加占油脂两倍体积的甲醇，继续催化反应20h，终止反应，催化反应在控温为
45℃的摇床中进行，摇床转速为100rpm；将反应体系的混合物离心10分钟，12000rpm，将上层液相部分移出，静置分层；取出静置分层后的下层液相，即为生物柴油粗品，再次离心10分钟，12000rpm，取出上层液相，加入2倍体积50℃的超纯水，充分搅动均匀，再次离心10分钟，12000rpm， 静置分层后得到的上层有机相，分离、取出上层有机相，即得生物柴油。
[0027] 对比例1不添加里氏木霉和黑曲霉，其余同实施例1。
[0028] 对比例2不添加黑曲霉，其余同实施例1。
[0029] 对比例3蛋白核小球藻、里氏木霉以及黑曲霉同时添加，其余同实施例1。
[0030] 实施例3本发明实施例和对比例中生物质干重含量、总脂肪含量（占生物质干重的百分比）以及油脂产量检测。具体检测结果见表1；
表1
组别 培养时间d 生物质干重含量g/L 总脂含量% 油脂产量g/L
实施例1 6 4.37 44.5 1.94
对比例1 6 3.02 35.2 1.06
对比例2 6 4.19 37.8 1.58
对比例3 6 3.74 41.6 1.56
结论：通过表1验证了菌株类型、添加时机对生物质干重含量、总脂肪含量以及油脂产量的影响，发现，实施例1物质干重含量、总脂肪含量以及油脂产量各指标均高于对比例1-
3；对比例1不添加菌株，仅采用藻类培养，各方面指标最低，油脂产量比实施例1降低了40%左右；对比例2仅采用里氏木霉，其中，里氏木霉利用发酵木薯渣产生还原糖，还原糖能够促进藻类的生长速率，增加生物量，但是与实施例1相比，持续充足的营养尽管可以维持较高的微生物质量，但是降低了油脂含量；对比例3同时接种黑曲霉，导致黑曲霉过渡竞争碳源，造成藻类养分不足，导致藻类生长缓慢；实施例1是待藻类基本达到较高生长量后，再接种黑曲霉，黑曲霉能够较快的速度利用氮源以及部分还原糖，从而与藻类产生竞争，使得藻类在氮限制和养分剥夺的胁迫条件下，通过养分限制来获得更高的油脂含量，而且黑曲霉还能够产生大量的二氧化碳无机碳源，从而提升藻类的油脂产量。
[0031] 实施例4不同脉冲电场时间对油脂产量的影响，以实施例1为例，分别设置0，100，200，400，
600us对油脂产量的影响，如图1所示，随着处理时间的增加，油脂产量增幅明显，200us后，增加处理时间并不会给油脂产量带来明显影响，因此选择200us最为合适。合适处理时间的强电场能够对细胞内极性分子产生影响，在细胞膜上产生震荡，发生不可恢复的破坏作用，使得细胞膜通透性增强，最终可以加快胞内外油脂的交换效率。
[0032] 实施例5超声功率和超声时间对油脂产量的影响：
设置超声功率为50w，100w，200w，400w，800w；超声提取时间为15，30，60，90，120min，如图2所示，随着超声功率和超声时间的增加，油脂产量逐步增加，最终超声功率选择100-
200W、处理时间为60-90min时，油脂的提取效果最佳。当超声波作用于液体反应体系时，由于超声波的空化作用，液体内会有大量微小的气泡形成，而且这些气泡的产生和破灭十分迅速，反应体系会产生局部的高温和高压，可以达到破坏植物细胞壁的作用，可以增加溶剂与胞内物质的接触机会。本发明利用脉冲电场协同超声波提取油脂是一个高效的方法，结合了二者的优势，不仅缩短了反应的时间，还可降低反应能耗。
[0033] 实施例6在实施例4的基础上，本发明还检测了各组别生物柴油的产率（生物柴油产率的计算，产率(Y)＝（生物柴油重量/微藻油脂重量）×100%，通过GC-MS分析了生物柴油的组成，具体见表2。
[0034] 表2组别 生物柴油的产率% C16总含量% C18总含量%
实施例1 81.6 39.2 57.7
对比例1 82.1 28.5 60.8
对比例2 81.3 35.6 56.4
对比例3 80.1 31.7 58.1
如表2所示，各组别生物柴油的产率相近，在80%左右。柴油中的C原子在16-18个比较合适，具备较好的流通性，易于氧化，能够保证充分燃烧，实施例1中生物柴油主要成分C16和C18的百分含量占油脂总量的96.9％，没有芳香烃的存在，可以保证充分燃烧，不会产生炭黑；C16和C18的百分含量明显高于对比例1-3，与传统柴油类似，可以作为传统柴油比较合适的替代品。
[0035] 最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明实施例技术方案的精神和范围。
