一种检测碱性磷酸酶的方法   0    0

本发明提供了一种检测碱性磷酸酶的方法，利用碱性磷酸酶ALP还原抗坏血酸磷酸酯AAP生成抗坏血酸AA，然后抗坏血酸使Cu2+还原成Cu+，Cu+可以抑制辣根过氧化物酶的活性，从而不能使TMB‑H2O2溶液变色，实现了ALP的检测。与现有技术相比，本发明利用比色法进行ALP的定量检测，灵敏度高，检测限低，而且准确度高。

1.一种检测碱性磷酸酶的方法，其特征在于，所述检测碱性磷酸酶的方法包括以下步骤：
a、将抗坏血酸磷酸酯AAP溶液和一系列浓度梯度的碱性磷酸酶ALP溶液混合在PBS缓冲溶液中，然后加入CuSO4溶液，反应，得到混合溶液；
b、分别在步骤a制备的混合溶液中加入HRP溶液，室温下反应后,加入TMB-H2O2显色溶液，分别检测其吸光度，构建碱性磷酸酶ALP溶液浓度与吸光度的线性关系；
c、利用线性关系，得到待检测碱性磷酸酶ALP溶液浓度。

2.根据权利要求1所述的检测碱性磷酸酶的方法，其特征在于，步骤a中所述一系列浓度梯度的碱性磷酸酶ALP溶液的浓度为：0 mU/mL,10 mU/mL,20 mU/mL,40 mU/mL,60 mU/mL,80 mU/mL,100 mU/mL和120 mU/mL。

3.根据权利要求1或2所述的检测碱性磷酸酶的方法，其特征在于，步骤a中，PBS缓冲溶液的pH为5-9。

4.根据权利要求1或2所述的检测碱性磷酸酶的方法，其特征在于，步骤a中所述反应，具体为在20-25℃下反应5-90min。

5.根据权利要求1或2所述的检测碱性磷酸酶的方法，其特征在于，步骤a具体为：将10 µL 1mg/mL的抗坏血酸磷酸酯AAP溶液和15 µL一系列浓度梯度的碱性磷酸酶ALP溶液混合在100mL pH=7.4的 PBS缓冲溶液中，浓度梯度分别为0 mU/mL,10 mU/mL,20 mU/mL,40 mU/mL,60 mU/mL,80 mU/mL,100 mU/mL和120 mU/mL，然后分别加入10 µL, 100 µg/mL CuSO4溶液，在室温下反应40 min。

6.根据权利要求1或2所述的检测碱性磷酸酶的方法，其特征在于，步骤b具体为：分别在上述步骤a所得混合溶液中加入50µL 10 ng/mL的 HRP溶液室温下反应20 min后,最后加入100 µL 8.3 mM的TMB-H2O2显色溶液，分别检测其吸光度，构建碱性磷酸酶ALP溶液浓度与吸光度的线性关系。