[0050] 下述实施例中，如无特殊说明，均为常规方法。
[0051] 实施例1
[0052] GmALMT1 基因的克隆
[0053] 1、基因 (GmALMT1)的克隆
[0054] 根据已报道的小麦TaALMT1-1（AB081803）和TaALMT1-2（AB081804），拟南芥AtALMT1（At1g08430）和油菜BnAlMT1（AB194300） BnAlMT2（AB194301）基因的氨基酸序列进行同源性比较，在高度保守区域设计上游简并引物5’-TGGGCIRTIHTIACIGTIGT-3’(SEQ ID NO:3)和下游简并引物5’- CCIGCCCAIAYIGGRMA -3’(SEQ ID NO:4)，并以按照TRIzol一步法提取磷高效基因型HN98大豆根尖总RNA，然后反转录得到的cDNA作为模板进行PCR扩增，PCR反应体系为50 µL，包含10 μM正反向引物各1 µL，10×PCR buffer 5 µL，2.5 mM dNTP 4 µL，Taq酶0.5 µL，cDNA模板量2.5 µL，然后用灭菌ddH2O补足50 µL。PCR反应程序为：94 ℃ 1分钟；94 ℃ 30秒，52 ℃ 30秒，72 ℃ 2分钟，扩增30个循环；72 ℃延伸10分钟。扩增的PCR产物通过1%琼脂糖胶电泳，通过Golden view核酸染料染色后，在凝胶成像系统成像。DNA凝胶回收试剂盒回收长度为405bp的PCR产物。回收得到PCR产物克隆到pMD18-T (TAKARA公司，具体描述见：http://www.takara.com.cn/)载体上进行测序鉴定。根据测序的结果，运用Primer 5.0引物设计软件，设计以下RACE PCR引物：
[0055] 3’特异引物 5’-GCCTCTTTATGATGGCTTCGGAGTTG-3’ (SEQ ID NO:5)[0056] 3’巢式引物 5’-AATGTGGGCTGTTCTGACAGTGGTG-3’ (SEQ ID NO:6)[0057] 5’特异引物 5’ -CAAGTACTGCTCCCAAGGATGGCGA -3’(SEQ ID NO:7)[0058] 5’巢式引物5’-GACGGGACAAATGAAAGTGGAGATGACC-3’(SEQ ID NO:8)。
[0059] 按照CLONTECH’s Advantage TM 2 PCR Kit操作说明进行。取5µL PCR产物进行电泳检测，二轮的PCR反应获得特异的产物，具体操作参照CLONTECH’s AdvantageT M 2 PCR Kit操作说明进行。然后用DNA凝胶回收试剂盒回收参照对3’/5’-RACE PCR的产物回收。回收得到PCR产物克隆到pMD18-T (TAKARA公司，具体描述见：http://www.takara.com.cn/)载体上进行测序鉴定。将以上获得GmALMT1 基因的3’和5’端的序列和前面得到的GmALMT1 的部分cDNA序列拼接得到大豆GmALMT1 全长cDNA序列。
[0060] 2、载体的构建
[0061] 过量表达载体的构建：以大豆根尖cDNA为模板，用上游特异引物5’-GGAAGATCTCATGGATATAGAGTCAACAACCCAAGC-3’(SEQ ID NO:9)
[0062] 和下游特异引物
[0063] 5’-CAGCACGCGTCTATTTACAAATTGAATGTTCCGAGGG-3’(SEQ ID NO:10)扩增GmALMT1 ORF 1461 bp片段，PCR片段回收测序无误后，通过Bgl Ⅱ和Mlu Ⅰ对片段及目的载体进行双酶切后，将GmALMT1 基因连接到目的载体pYLRNAi。
[0064] 干涉载体的构建：以大豆根尖cDNA为模板，用上游特异引物
[0065] 5’-GGATCCTGGTCGCTGTCTCG-3’ (SEQ ID NO:11) 和 下 游 特 异 引 物5’-AAGCTTACATTCCCGAGTAAGTGCT-3’ (SEQ ID NO:12) 扩增392 bp目的片段，用BamH Ⅰ和Hind Ⅲ分别酶切PCR产物和目的载体pYLRNAi，回收产物纯化后连接载体，转化大肠杆菌Top10F’(由刘耀光研究员实验室惠赠，具体描述见文献：Wang et al., 2006, The Plant Cell)，测序无误后，用上游特异引物 5’- CTGCAGACATTCCCGAGTAAGTGCT-3’ (SEQ ID NO:13) 和下游特异引物5’-ACGCGTTGGTCGCTGTCTCG -3’(SEQ ID NO:14)扩增反向片段，用Pst Ⅰ和Mlu Ⅰ双酶切反向片段和带有正向片段的载体后，将反向片段连接到包含有正向片段的目的载体pYLRNAi中，转化大肠杆菌Top10F’，测序无误后转化发根农杆菌K599 (由澳大利亚昆士兰大学豆科综合研究中心惠赠，保存于华南农业大学根系生物学研究中心实验室，具体描述见文献Kereszt A, et al.，2007)，用于农杆菌介导的大豆下胚轴注射法进行毛根转化。
[0066] 亚细胞定位分析表达载体的构建：按照常规方法，提取大豆根部RNA，并将其反转录成cDNA，以该cDNA为模板，用上游特异引物
[0067] 5’- TCTAGAGATGGATATAGAGTCAACAACC -3’(SEQ ID NO:15)
[0068] 和下游特异引物
[0069] 5’- GGTACCAGACAAATTGAATGTTCCGAG -3’(SEQ ID NO:16)
[0070] 扩增GmALMT1 开放阅读框片段，PCR片段回收测序无误后,将GmALMT1基因连接到目的载体EGFP。
[0071] 电生理表达载体的构建：按照常规方法，提取大豆根部RNA，并将其反转录成cDNA，以该cDNA为模板，用上游特异引物
[0072] 5’-CTTGCAGATCTGCCGCCACCATGGATATAGAGTCA-3’(SEQ ID NO:17)
[0073] 和下游特异引物5’-GCAAGACTAGTCTATTTACAAATTGA-3’ (SEQ ID NO:18)[0074] 扩增GmALMT1 开放阅读框片段，PCR片段回收测序无误后，通过Bgl II和SpeI对回收片段及目的载体进行双酶切后，将GmALMT1 基因连接到目的载体T7TS。
[0075] 3、GmALMT1的亚细胞定位及其基因的表达模式分析
[0076] 1）GmALMT1的亚细胞定位分析
[0077] 通过基因枪转化法，将装载了GmALMT1的EGFP载体和EGFP空载体导入洋葱表皮细胞和大豆原生质体进行瞬时表达。然后用共聚焦显微镜(TCS SP2; Leica)和荧光显微镜(LEICA DM5000B, Germany)分别观察洋葱表皮细胞和大豆原生质体的GFP和PI荧光信号。结果见图4为 GmALMT1的亚细胞定位分析。其中A-C为洋葱表皮对照：35S启动子驱动的空载，A为GFP荧光信号；B为PI信号；C为A和B的融合结果；D-F为GmALMT1-GFP在洋葱表皮的亚细胞定位，D为GmALMT1-GFP荧光信号；E为PI信号；F为D和E的融合结果。G为大豆原生质体对照：35S启动子驱动的空载；H-I为GmALMT1-GFP在大豆原生质体的亚细胞定位，H为GmALMT1-GFP荧光信号； I为H和明场的融合结果。图中除A-F标尺为100 μm；G-I标尺为20 μm。
[0078] 2）GmALMT1 基因的表达模式分析
[0079] GmALMT1 基因表达的组织特异性分析：
[0080] 大豆种子在正常营养液发芽3天后，将生长一致的幼苗转移到含50 µM AlCl3的0.5 mM CaCl2溶液（pH值为4.3）中处理6小时，分别提取0-2 cm，2-4 cm, 4-7 cm根段的RNA。
[0081] 铝浓度对GmALMT1 基因表达的影响：
[0082] 大豆种子在正常营养液发芽3天后，将生长一致的幼苗转移到含0、50、100 µM AlCl3的0.5 mM CaCl2溶液（pH值为4.3）中处理6小时，提取0-2 cm根段的RNA。
[0083] 低pH值和铝对GmALMT1 基因表达的影响：
[0084] 大豆种子在正常营养液发芽3天后，将均一的幼苗转移到0.5 mM CaCl2溶液（pH值为4.3）中处理0，6，12小时，然后转移到含50 µM AlCl3的0.5 mM CaCl2溶液（pH值为4.3）中处理2，4，6，8，10，12和24小时。每个时间点分别采集0-2 cm的根段，抽提RNA。
[0085] 铝、pH值和磷对GmALMT1基因表达的影响：
[0086] 大豆种子分别在正常营养液和缺磷营养液中发芽3天后，将均一的幼苗转移到不同的处理，即+Al/+P/pH4.3, +Al/-P/pH4.3, -Al/+P/pH4.3, -Al/+P/pH5.8, -Al/-P/pH4.3 和 -Al/-P/pH5.8。其中pH 分别为4.3 和 pH 5.8；磷处理分别为320 µM (+P)和3+ 3+
0 µM (-P)；铝处理分别为38 µM Al (+Al) 和0 µM Al (-Al)。 用GEOCHEM-EZ计算铝的活性。处理6小时后采集0-2 cm的根段，抽提RNA。
[0087] 将上述RNA反转录成cDNA，进一步用定量PCR检测GmALMT1 的表达模式。大豆的看家基因TefS1 作为内参。用于定量PCR 检测基因表达量的引物分别为：
[0088] 大豆TefS1 基因的引物为：
[0089] TefS1 F: 5’- TGCAAAGGAGGCTGCTAACT -3’ (SEQ ID NO:19)
[0090] TefS1 R: 5’- CAGCATCACCGTTCTTCAAA -3’ (SEQ ID NO:20)
[0091] GmALMT1 基因的引物为：
[0092] GmALMT1F: 5’-GAGCACTTACTCGGGAATGTG-3’ (SEQ ID NO:21)
[0093] GmALMT1 R: 5’-GGACTTTGGCAGTTGATGGG-3’ (SEQ ID NO:22)
[0094] 图5为低pH值和铝对GmALMT1表达模式的影响。其中A：GmALMT1基因在根部的不同区段的表达量；B：铝浓度对GmALMT1基因表达的影响；C：低pH值和铝对GmALMT1基因表达的影响。图中数据为4个重复的平均值和标准误差。
[0095] 图6为pH值、铝和磷的有效性对GmALMT1表达模式的影响。其中A为高磷的条件下，pH值对GmALMT1基因在根尖表达的影响；B为低磷的条件下，pH值对GmALMT1 基因在根尖表达的影响；C为磷铝互作对GmALMT1 基因在根尖表达的影响。图中数据为4个重复的平均值和标准误差。星号表示同一指标在两个基因型之间的显著性比较：*表示显著水平P <0.05时，差异显著；**表示显著水平0. 001 < P <0.01时，差异显著性介于显著与极显著之间；***表示显著水平P <0.001时，差异极显著；ns表示差异不显著。
[0096] 4、GmALMT1功能的电生理研究
[0097] 将构建好的GmALMT1-TST7载体反转录成cRNA。 挑选良好的蛙卵细胞，注射约30 ng GmALMT1-TST7，对照试验注射30 nL水。同时向蛙卵注射50 nL 浓度为0到 100
2-
mM的苹果酸钠，使内源苹果酸活性分别为1.3, 2.4和4.5 ({mal }i)。缓冲液pH值调整为7.5或4.5，用双电极电压钳检测。利用pCLAMP 10.0 (美国Axon 公司)和Digidatas
1320A 软件进行图像处理及数据分析。图7为GmALMT1功能的电生理研究。A，苹果酸活性对GmALMT1通道电流的影响；B，pH值对GmALMT1通道电流的影响；C，pH值为7.5时，苹果酸活性对GmALMT1的I-V 曲线的影响；D，pH值为4.5时，苹果酸活性对GmALMT1的I-V 曲线的影响。
[0098] 实施例2 转基因复合植株的研究
[0099] 1、转基因材料的获得
[0100] 1）转基因大豆复合植株的获得
[0101] 将构建好的表达载体和干涉载体转化至发根农杆菌K599中，采用农杆菌介导的大豆下胚轴注射法获得转基因复合植株 (根部为转基因毛状根、地上部为非转基因)，后续的表型鉴定均使用此株系。空载体对照：按照上述方法，将表达载体pYLRNAi同样方法转化大豆，获得转pYLRNAi空载对照株系 (CK)。
[0102] 2）转基因拟南芥植株的获得
[0103] 将构建好的表达载体质粒转化至根癌农杆菌Gv3101中，采用农杆菌介导的拟南芥花序转染法获得转基因拟南芥植株。空载体对照：按照上述方法，将表达载体pYLRNAi同样方法转化拟南芥，获得转pYLRNAi空载对照株系 (CK)。
[0104] 2、转基因材料的检测
[0105] 1）转基因大豆复合植株的检测
[0106] 毛状根形成后21天，采根部样品提取RNA，反转录成cDNA后，进一步用定量PCR检测过表达及干涉的效果。
[0107] 2）转基因拟南芥植株的检测
[0108] 采集T1代拟南芥种子经潮霉素抗性筛选后，获得T1代转基因植株；采集T2代种子用潮霉素抗性筛选，获得成苗率为60%的T2代植株；采集T3代种子，用潮霉素抗性筛选，获得成苗率为100%转基因系。提取该转基因系植株的RNA，反转录成cDNA后，进一步用定量PCR检测过表达的效果。
[0109] 大豆看家基因TefS1和拟南芥的tubulin作为参照基因，相对表达量为目的基因GmALMT1 的表达量与看家基因表达量的比值。大豆看家基因TefS1的检测引物为SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:20；GmALMT1的检测引物为SEQ ID NO:21和SEQ ID NO:22。
[0110] 1)拟南芥tubulin基因的引物为：
[0111] tubulin F: 5’- TGTCGTCCAACCTTACAACTCACT -3’ (SEQ ID NO:23)[0112] tubulin R: 5’- TCTCCAGGGTCCTCCATTCC -3’ (SEQ ID NO:24)
[0113] 2) 反应体系：
[0114] 2×SYBR Green PCR master mix： 10 μL
[0115] 上游引物. (10 mol/L)： 0.6 μL
[0116] 下游引物. (10 mol/L)： 0.6 μL
[0117] Mili-Q水： 补至20 μL
[0118] 稀释的cDNA： 2 μL
[0119] 3) 反应条件：
[0120] 95℃预变性1 min，然后按95℃变性15 s，55-60℃退火15s，进行35-40个循环，最后72℃延伸30 s。定量PCR确认得到有效的不同转基因株系。
[0121] 3、转基因复合植株表型分析
[0122] 1) 毛状根根系苹果酸分泌量的测定
[0123] 将阳性转基因大豆复合株系以及对照株系转移到4.3 mM CaCl2溶液(pH值为4.3)中培养6小时后，收集根系分泌物。将20 mL分泌物用阳离子交换树脂处理后，用冷冻干燥法浓缩为1mL。经0.45mm滤膜过滤后用HPLC仪器测定样品中的苹果酸含量。
[0124] 2) 苏木精染色检测转基因毛状根的耐铝性
[0125] 将阳性转基因大豆复合株系以及对照株系经6小时铝处理后，剪下其根尖部位，用苏木精染液染色约半小时。取出根尖，用清水冲洗表面附着的苏木精染料，在体式显微镜下观察染色情况。
[0126] 图8为GmALMT1 基因对大豆复合植株苹果酸分泌量及其耐铝性的影响。其中A：GmALMT1 基因在转基因大豆毛状根的表达量分析；B：GmALMT1过量和干涉株系以及对照毛状根的苹果酸分泌量；C：GmALMT1过量和干涉株系以及对照毛状根表面铝的积累。CK，转化空载的对照株系；OX, GmALMT1的超表达株系；RNAi, GmALMT1 的干涉株系。星号表示同一指标在过量和干涉株系与对照株系之间的显著性比较：*表示显著水平P <0.05时，差异显著；**表示显著水平0. 001 < P <0.01时，差异显著性介于显著与极显著之间；***表示显著水平P <0.001时，差异极显著；ns表示差异不显著。
[0127] 4、转基因拟南芥耐铝性分析
[0128] 1) 根部有机酸的分泌
[0129] 转基因和野生型拟南芥在MS培养基萌发一星期后，将大小一致的幼苗转移到液体MS培养基中继续培养10天。将液体MS培养倒掉，用pH值为4.3的0.5 mM CaCl2溶液清洗植株3遍，将培养液换成0.5 mM CaCl2溶液（pH值为4.3），培养24小时后，收集培养液测定苹果酸含量。
[0130] 2）铝对根生长的影响
[0131] 转基因和野生型拟南芥在MS 培养基萌发4天后，将大小一致的幼苗转移到含0或400 µM AlCl3 的CaCl2固体培养基（CaCl2 浓度为0.5 mM，pH值为4.3）并测定主根根长。
铝处理2天后，再次测定主根根长。计算根的相对生长。
[0132] 图9为GmALMT1 基因的表达对转基因拟南芥耐铝性的影响。其中A：GmALMT1 基因在转基因拟南芥中的表达量分析；B：GmALMT1 不同转基因株系和野生型拟南芥根部的苹果酸分泌量；C：GmALMT1不同转基因株系和野生型拟南芥在铝处理条件下的表型分析。D：GmALMT1 不同转基因株系和野生型拟南芥相对根生长量的比较。CK，转化空载的对照株系；
OX, GmALMT1 的超表达株系；星号表示同一指标在超表达株系与对照株系之间的显著性比较：*表示显著水平P <0.05时，差异显著；**表示显著水平0. 001 < P <0.01时，差异显著性介于显著与极显著之间；***表示显著水平P <0.001时，差异极显著；ns表示差异不显著。
[0133] 5、田间试验与水培试验
[0134] 图1为田间试验中大豆的总根长和生物量。A：田间试验大豆总根长；B：大豆植株干重；试验中每个处理设6个重复，图中柱子为试验各处理6个重复数据的平均值和标准误差。星号表示同一指标在同一处理不同基因型之间进行差异显著性比较的结果，即*表示显著水平P <0.05时，差异显著；**表示显著水平0.001< P <0.01时，差异显著性介于显著与极显著之间；***表示显著水平P <0.001时，差异极显著。
[0135] 图2为水培试验中铝、pH值和磷有效性对大豆根生长的影响。A：图中所示为高磷和低磷条件下加铝对大豆相对根生长的影响；B：图中所示为没有铝处理的条件下，磷和pH值对大豆相对根生长的影响。其中pH分别为4.3和pH 5.8；磷处理分别为320 µM (+P) 和3+ 3+
0 µM (-P)；铝处理分别为38 µM Al (+Al) 和0 µM Al (-Al)，铝的活性由GEOCHEM-EZ计算。试验中每个处理设4个重复，图中柱子为试验各处理4个重复数据的平均值和标准误差。星号表示同一指标在同一处理不同基因型之间进行差异显著性比较的结果，*表示显著水平P <0.05时，差异显著；**表示显著水平0. 001
[0136] 图3为水培试验中铝、pH值和磷有效性对大豆根系苹果酸积累和分泌的影响。A：高磷条件下，pH值和铝对大豆苹果酸分泌的影响；B：低磷条件下，pH值和铝对大豆苹果酸分泌的影响C：高磷条件下，pH值和铝对大豆苹果酸积累的影响D：低磷条件下，pH值和铝对大豆苹果酸积累的影响。试验中每个处理设4个重复，图中柱子为试验各处理4个重复数据的平均值和标准误差。星号表示同一指标在同一处理不同基因型之间进行差异显著性比较的结果，*表示显著水平P <0.05时，差异显著；**表示显著水平0. 001
