[0006] 针对以上不足,本发明提供了一种葡萄糖的检测方法,解决了现有技术中对葡萄糖检测的操作要求高,检测过程复杂,检测成本高,检测时间长,背景干扰大等问题,且制备材料的方法简单环保,成本低、操作简便、灵敏度高,能够快速检测样品中葡萄糖含量。
[0007] 为了实现上述目的,本发明采取的技术方案为:一种异硫氰酸荧光素修饰的负载葡萄糖氧化酶的聚多巴胺复合材料的制备方法,包括如下步骤:
[0008] A、PDA-FITC复合材料的制备:在装有乙醇水溶液的烧杯中加入氨水,调节pH至8.4-8.6,得混合溶液,然后加入多巴胺盐酸盐和异硫氰酸荧光素FITC,置于30℃水浴中搅拌28-30h,得悬浮液,于悬浮液中加入HCl稀溶液,调节pH至4.8-5.0,再置于离心机中离心,得下层沉淀,将离心好的下层沉淀分散到蒸馏水中,即为PDA-FITC复合材料水溶液,其中,氨水与乙醇水溶液的体积比为1:(48-52),多巴胺盐酸盐和异硫氰酸荧光素FITC的质量比为(50-200):(2.5-10),多巴胺盐酸盐在乙醇水溶液中的固含量为(1.5-7)mg/mL,蒸馏水与乙醇水溶液的体积比为1:2;
[0009] B、PDA-FITC-GOx复合材料的制备:向步骤A制备的PDA-FITC复合材料水溶液中加入PBS缓冲液,葡萄糖氧化酶GOx和蒸馏水,恒温振荡反应24h,再加入HCl稀溶液调节pH至4.8-5.0,将调好pH的悬浮液用离心机离心得下层沉淀,将离心好的下层沉淀再分散到蒸馏水中,加入NaOH稀溶液调节pH至7.3-7.5,即为PDA-FITC-GOx复合材料水溶液;其中,PDA-FITC复合材料水溶液、PBS缓冲液、蒸馏水的体积比为5:1:14,第一次蒸馏水与第二次蒸馏水的体积比为4:10,葡萄糖氧化酶GOx在PDA-FITC复合材料水溶液中的固含量为(0.5-2)mg/mL。
[0010] 优选地,所述多巴胺盐酸盐和异硫氰酸荧光素FITC的质量比为20:1。
[0011] 所述乙醇水溶液的体积百分比浓度为25%-35%。
[0012] 所述氨水的质量百分比浓度为28%,HCl稀溶液的浓度为1mol/L,NaOH稀溶液的浓度为1mol/L。
[0013] 所述PBS缓冲液的pH为6.3-6.6。
[0014] 所述恒温为25℃。
[0015] 所述离心转速为6000-8000r/min,时间为25-30min。
[0016] 采用上述异硫氰酸荧光素修饰的负载葡萄糖氧化酶的聚多巴胺复合材料的制备方法制备的PDA-FITC-GOx复合材料在检测葡萄糖浓度方面的应用,采用下述方法步骤:
[0017] 取一系列5mL具塞刻度比色管,分别向每支比色管中加入100μL上述制备的PDA-FITC-GOx复合材料水溶液,再分别向每支比色管中依次加入0-80μL不同体积的葡萄糖溶液,每支比色管稀释至1mL,恒温振荡反应1h后,置于荧光比色皿中用荧光光谱仪在激发波长470nm、发射波长523nm时测定荧光强度;以葡萄糖浓度为横坐标,反应液在523nm波长处的荧光强度值为纵坐标,在直角坐标系中作图,得到葡萄糖浓度与荧光强度之间的线性关系图,根据它们之间的这种线性关系以检测葡萄糖的浓度。
[0018] 所述线性关系图中的工作曲线为y=200.25+42.93x,线性相关系数R2为0.98。
[0019] 所述的葡萄糖溶液的终浓度分别为0μM、5μM、10μM、15μM、20μM、30μM、40μM、50μM、60μM、70μM、80μM。
[0020] 所述PDA-FITC-GOx复合材料在检测葡萄糖浓度方面的应用,具体步骤如下:
[0021] A、PDA-FITC复合材料的制备:在30mL乙醇水溶液中加入0.6mL氨水调节pH至8.4-8.6,之后加入50~200mg多巴胺盐酸盐和2.5~10mg异硫氰酸荧光素FITC,再置于30℃水浴中搅拌30h后加入HCl稀溶液调节pH至5.0,将调好pH的悬浮液用离心机离心得下层沉淀,将离心好的下层沉淀再分散到60mL蒸馏水中,即得PDA-FITC复合材料水溶液;
[0022] B、PDA-FITC-GOx复合材料的制备:向5mL步骤A制备的PDA-FITC复合材料水溶液中加入1mL pH为6.5的PBS缓冲液,5-40mg的葡萄糖氧化酶GOx和4mL蒸馏水,恒温振荡反应24h,加入HCl稀溶液调节pH至4.8-5.2,将调好pH的溶液用离心机离心得下层沉淀,将离心好的下层沉淀再分散到10mL蒸馏水中,加入NaOH稀溶液调节pH至7.4,即得PDA-FITC-GOx复合材料水溶液;
[0023] C、葡萄糖的检测:取11支5mL具塞刻度比色管,分别向每支比色管中加入100μL步骤B制备的PDA-FITC-GOx复合材料水溶液,再分别向每支比色管中依次加入0μL、5μL、10μL、15μL、20μL、3μL、40μL、50μL、60μL、70μL、80μL浓度为1×10-3M的葡萄糖溶液,每支比色管稀释至1mL,恒温振荡反应1h后,置于荧光比色皿中用荧光光谱仪在激发波长470nm、发射波长
523nm时测定荧光强度;以葡萄糖浓度为横坐标,反应液在523nm波长处的荧光强度值为纵坐标,在直角坐标系中作图,得到葡萄糖浓度与荧光强度之间的线性关系图,其线性关系图中的工作曲线为y=200.25+42.93x,线性相关系数R2为0.98,根据它们之间的这种线性关系以检测葡萄糖的浓度。
[0024] 所述检测方法能够排除其他物质的干扰;所述的其他物质为:NaCl、KCl、CaCl2、D-山梨糖、D-果糖、D-半乳糖、D-甘露糖和D-麦芽糖。
[0025] 本发明的有益效果:本发明采用异硫氰酸荧光素FITC修饰的负载葡萄糖氧化酶GOx的聚多巴胺PDA复合材料PDA-FITC-GOx,利用葡萄糖在葡萄糖氧化酶的作用下会产生葡萄糖酸,葡萄糖酸可以猝灭FITC,而其他糖类不影响荧光强度,通过荧光光谱法实现对葡萄糖浓度的检测。本发明解决了现有技术中对葡萄糖检测的操作要求高,检测过程复杂,检测成本高,检测时间长,背景干扰大等问题,本发明的方法成本低、操作简便、能够快速检测样品中葡萄糖含量。