[0027] 以下非限制性实施例可以使本领域的普通技术人员更全面地理解本发明，但不以任何形式限制本发明。凡基于本发明上述内容所实现的技术均应当属于本申请要求保护的范围之中。
[0028] 以下实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂生物材料、检测试剂盒，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
[0029] 实施例1人乳铁蛋白突变体的确定和制备
[0030] 所述人乳铁蛋白突变体，以人源乳铁蛋白为基础，利用生物信息学手段和已有人乳铁蛋白结构解析数据，设计相应的定点突变，经过分子水平和细胞水平实验验证筛选而得，经鉴定所述人乳铁蛋白突变体的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，其核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。
[0031] 以大肠杆菌为宿主菌制备本发明中所述的人乳铁蛋白突变体。首先设计上下游PCR引物扩增人乳铁蛋白突变体(以下简称mu‑hLF)基因，并在上下游引物中分别引入EcoRI和XhoI酶切位点；其次用EcoRI和XhoI双酶切表达载体pET28a和mu‑hLF基因片段，酶切连接后得到重组表达载体pET28a‑mu‑hLF，然后将该重组表达载体电转化导入宿主菌E.coli BL21(DE3)中；在5L生物反应器中培养上述宿主菌，达到对数生长状态后，流加输入诱导剂IPTG，诱导表达生产目标蛋白，诱导表达16‑24h后，4℃、8000rpm离心收集菌体，超声破碎后通过亲和层析色谱柱分离获得重组人乳铁蛋白突变体蛋白，经高效液相色谱鉴定所述蛋白纯度达98％以上，满足后续实验要求。
[0032] 实施例2重组人乳铁蛋白突变体对不同微生物生长的影响
[0033] 2.1重组人乳铁蛋白突变体促进益生菌生长
[0034] 取冻存的双歧杆菌(包括长双歧杆菌和短双歧杆菌)、乳杆菌、乳球菌菌株，上述菌株本实验室保存，复苏后接种与无菌LB培养基中活化培养24小时；离心收集菌体，使用无菌5
LB培养基调整菌体浓度至1×10CFU/mL，分别取上述4种益生菌1mL接种于20mL无菌LB培养基中；将各个益生菌分为三组，分别加入50mg/mL的mu‑hLF蛋白、50mg/mL天然人乳铁蛋白(以下简称hLF)和等体积的无菌水(作为空白对照)，于摇床上37℃培养24后，使用分光光度计测量OD600数值。
[0035] 结果如图1所示，天然和突变的人乳铁蛋白均能够促进双歧杆菌、乳杆菌和乳球菌生长，但是本发明中所提供的mu‑hLF在促进双歧杆菌生长方面具有明显优势，在添加mu‑hLF的培养液中双歧杆菌的数量远高于hLF组和对照组，尤其是对于长双歧杆菌，这种促增殖作用更加明显；但在乳杆菌和乳球菌中，虽然mu‑hLF也有明显的生长促进作用，但是相比于天然hLF未见显著差异。
[0036] 2.2重组人乳铁蛋白突变体抑制有害菌生长
[0037] 取沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌、产气荚膜梭菌菌株(本实验室保存)，验证人乳铁蛋白对其抑制作用，具体实验步骤同2.1节。结果图2所示，天然人乳铁蛋白和突变修饰的人乳铁蛋白具有展现出了对多四种有害微生物的抑制作用，其中在绿脓杆菌中，mu‑hLF的抑制作用似乎强于天然人乳铁蛋白，但在其他三种有害细菌中二者取未见显著差异。
[0038] 实施例3重组人乳铁蛋白与双歧杆菌组合物的制备
[0039] 本实施例中选择在前期实验中促增殖作用最强的长双歧杆菌菌，与人乳铁蛋白突变体制成组合物，用于验证其体内服用效果，具体步骤如下：
[0040] 首先制备mu‑hLF蛋白和hLF蛋白，具体步骤参考实施例1，将获得的蛋白冷冻干燥，获得蛋白质粉；其次制备长双歧杆菌菌粉，将长双歧杆菌接种于无菌LB培养基中活化培养约24h，将活化后的菌体接种于5L生物反应器中，37℃下进行培养，每小时检测pH和OD值，待其生长状态进入稳定期后结束发酵，低温离心、收集菌体，磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤后，加冻干保护剂(脱脂奶粉)后进行乳化，完成后进行真空冷冻干燥，得到长双歧杆菌菌粉；最后制备人乳铁蛋白与长双歧杆菌组合物，将上述两种组分按照1:10比例混合，分别获得mu‑hLF‑Bp组合物和hLF‑Bp组合物。
[0041] 实施例4重组人乳铁蛋白与双歧杆菌组合物的体内实验
[0042] 为验证本发明中所提供的mu‑hLF蛋白与益生菌联合改善机体免疫机能的效果，本实施例中采用大鼠模型，口服人乳铁蛋白与双歧杆菌组合物后，考察其对于免疫能力的影响。
[0043] 4.1实验动物处理
[0044] 选取健康SD大鼠，SPF级，雌雄各半，体重180±20g，随机分组，每组10只，共3组，包括生理盐水组、mu‑hLF‑Bp组、hLF‑Bp组，其中mu‑hLF‑Bp组每日口服100mg/kg的mu‑hLF‑Bp组合物，hLF‑Bp组每日口服100mg/kg的hLF‑Bp组合物，生理盐水组每日口服1mL无菌生理盐水，共口服30天后进行检测。
[0045] 4.2机体免疫能力检测
[0046] 免疫球蛋白是具有抗体活性的，与抗体分子相似的球蛋白，它是机体免疫的重要组成部分，可帮助机体对抗多种有害物质的侵袭，包括细菌、病毒、有害异物等等，免疫球蛋白分为五类，即免疫球蛋白G(IgG)、免疫球蛋白A(IgA)、免疫球蛋白M(IgM)、免疫球蛋白D(IgD)和免疫球蛋白E(IgE)，其中IgG、IgA、IgM在血清中的含量较多，其生理活性也最为重要，因此本实施例中通过检测上述三种免疫球蛋白的含量来考察对于机体免疫能力的影响。
[0047] 大鼠尾静脉取血，将全血以3000rpm的速率离心10min。吸取上清液，采用IgA、IgG、IgM免疫球蛋白试剂盒(购自南京建成生物公司)检测血液中IgA、IgG、IgM含量，结果如图3所示，乳铁蛋白和长双歧杆菌构成的组合物对于上述三种免疫球蛋白浓度均有提升作用，但是在IgM方面，mu‑hLF‑Bp组合物相比于hLF‑Bp组合物并没有展现出更多优势，血液中的IgM水平没有显著变化；在IgA、IgG方面，使用人乳铁蛋白突变体与双歧杆菌组合，则能够显著增加相应的免疫球蛋白水平。
[0048] 众所周知，IgG是血清中免疫球蛋白的主成分，约占血清中免疫球蛋白总含量的75％，是体内最主要的抗体，具有抗病毒、中和病毒、抗菌及免疫调节的功能。IgA是血清中的含量仅次于IgG，占血清免疫球蛋白的10～20％，多存在于黏膜组织，如消化道、呼吸道、泌尿生殖系统等，也具有强大的抗菌、抗病毒和免疫调节功能。本申请中所提供的mu‑hLF‑Bp组合物能够显著提升IgA、IgG水平，说明其能够有效激活和促进机体的自身免疫水平，进而有效预防外界有害物质的侵袭和干扰。
[0049] 4.3抗氧化能力检测
[0050] 活性氧(reactive oxygen species,ROS)是体内一类氧的单电子还原产物，是线粒体由状态Ⅲ向状态Ⅳ转换中高氧的环境和高还原态的呼吸链使大量电子漏出并还原氧分子而形成。活性氧是机体内正常代谢的产物，具有积极作用，如辅助吞噬细胞发挥杀伤作用，但是当其含量升高，造成活性氧的产生和清除失衡，则会引起活性氧对人体中的核苷酸、蛋白质、细胞膜造成广泛的损伤，从而引发多种疾病。
[0051] 本实施例中为研究所述组合物对ROS的作用效果，使用试剂盒(购自南京建成生物公司)检测血清中活性氧含量。结果如图4所示，mu‑hLF‑Bp组合物可显著降低血清中ROS含量，其作用效果强于hLF‑Bp组合物，表明这种联合使用可产生有效的协同作用，清除体内过量的氧自由基，保护机体免疫氧化应激损伤。
[0052] 以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。
