一种提前产生再生稻分蘖进而提高再生稻产量的方法   0    0

[0001] 本发明属于农业生物技术领域，具体涉及一种提前产生再生稻分蘖以提高再生稻产量的方法，更具体地是利用特异启动子将OsmiR156家族基因在茎杆中特异表达以提前产生再生稻分蘖进而提高再生稻产量的方法。

[0002] 自20世纪初以来，我国的再生稻生产进入了快速发展时期，先后经历了高杆再生稻组合利用、矮杆再生稻组合利用、杂交稻的再生利用等发展阶段，目前我国再生稻的应用与研究进展很快，先后获得了一批米质好、再生力强的新品种(组合)，如培64/E32、培两优50、Ⅱ优1273、Ⅱ优航2号等。

[0003] 水稻分蘖的形成过程可分为两个主要步骤，即分蘖芽的形成和分蘖芽的伸长。分蘖芽的伸出时间对稻穗长度及籽粒充实度等具有重要影响。水稻生产中只有主茎和早期发生的初生和次生分蘖才具备成穗能力，它们属于有效分蘖；而后期的次生分蘖因生育期短等因素造成不能成穗，它们属于无效分蘖。无效分蘖不仅不能形成稻穗，而且过多的无效分蘖还会影响有效分蘖稻穗的长度而导致水稻产量减低等问题。再生稻的稻穗是由第一季(头季)水稻形成的腋芽发育而成，在头季水稻收割之后，一些腋芽在原有根系的基础上再次生长、抽穗直至成熟。因此这些腋芽伸出的时间对再生稻穗长及产量具有重要影响。

[0004] 由于再生稻分蘖能力大小、有效穗的形成等对产量具有决定性的影响。因此，国内外对再生稻的研究多集中于品种的选育、高产优质栽培管理技术等方面。罗文质等研究了1500多个水稻品种(组合)的再生力，为再生稻品种的选育提供了重要参考。虽然再生稻生产技术取得了一些重要进展，但目前还存在产量相对较低、充实程度差等问题。

[0005] 现有再生稻生产完全依赖于水稻的再生特性：在头季稻收割后由留在稻桩上的休眠芽萌发生长成穗而收割下一季水稻，因此再生芽的萌发与成穗率的高低直接影响再生稻的产量。目前推广的再生稻品种一般存在再生芽的萌发率低(分蘖力差)、萌发时间迟、再生稻穗偏短等缺陷。随着分子生物学和基因工程技术的迅猛发展，利用水稻分蘖相关基因来调控分蘖发育为水稻生产开辟了一个全新的途径，并取得了一些重要进展。目前可利用转基因方法将一些优质基因导入水稻以调控水稻分蘖发育而增加稻穗的长度、千粒重等，进而增加水稻产量。但由于通过转基因技术获得的多分蘖转基因水稻材料的分蘖数目常常太多而对水稻头季水稻产量不利，因此，即使能够增加水稻的分蘖力或再生稻的稻穗数等，在生产实际中缺乏应用价值。

[0006] 迄今为止，通过传统育种手段选育的具有多分蘖特性的水稻品种(材料)增产效果不理想。即使获得多再生稻穗的品种，但由于生育期较短导致光合作用时间少，稻穗的长度及籽粒充实度等问题而导致增产效果不佳。

[0007] 再生稻的稻穗是由叶腋中的分蘖芽生长发育而来，因此让这些叶腋中的分蘖芽适当提前生长出来有利于延长生育期、增加光合作用进而提高再生稻产量。目前已知miR156家族成员基因可影响水稻分蘖发育过程中的蘖芽发生及蘖芽伸出两过程。本发明利用miR156家族基因能够影响水稻发育过程的功能，采用组织器官特异启动子构建载体，使得转基因水稻叶腋芽中的分蘖芽在头季稻成熟期时从叶腋中生长、萌发形成新的分蘖，这些早期萌发的分蘖相对于那些等头季稻收割后再萌发的分蘖芽具有更长的生育期、更多的较长稻穗，更好的籽粒充实度等性状，这样就可以提高再生稻产量，进而达到增产目的。

[0008] 因此，本发明的目的是提供一种提前产生再生稻分蘖进而提高再生稻产量的方法，是通过将对水稻发育具有重要调控作用的miR156家族的12个成员OsmiR156a～l中的任何一个或多个基因导入水稻以调控水稻的分蘖发育进程。

[0009] 为达上述目的，本发明所采用的技术方案是：一种提前产生再生稻分蘖进而提高再生稻产量的方法，该方法是将至少一个重组表达载体导入水稻中，使其于水稻茎杆中表达；其中，上述重组表达载体为含有水稻茎杆特异表达启动子及其驱动的如序列表中SEQ ID No.1或SEQ ID No.2或SEQ ID No.3或SEQ ID No.4或SEQ ID No.5或SEQ ID No.6或SEQ ID No.7或SEQ ID No.8或SEQ ID No.9或SEQ ID No.10或SEQ ID No.11或SEQ ID No.12所示的核心序列(OsMIR156a～l基因片段序列)的载体。

[0010] 上述水稻茎杆特异表达启动子是驱动核心序列如序列表中SEQ ID No.1或SEQ ID No.2或SEQ ID No.3或SEQ ID No.4或SEQ ID No.5或SEQ ID No.6或SEQ ID No.7或SEQ ID No.8或SEQ ID No.9或SEQ ID No.10或SEQ ID No.11或SEQ ID No.12所示的启动子。该水稻茎杆特异表达启动子为D18p启动子。

[0011] 本发明还保护上述方法在水稻提前产生再生稻分蘖中的应用。

[0012] 与传统的再生稻品种一般是等头季稻收割后叶腋中的分蘖芽再萌发形成再生稻分蘖的步骤不同，本发明利用特异启动子驱动OsmiR156a～l的载体的构建及水稻愈伤组织的外源基因导入等技术，通过组织器官特异启动子将能够影响水稻分蘖发育的OsMIR156a～l基因序列在水稻的茎杆中特异表达。实施该技术获得的转基因植株的效果表明，利用特异启动子过表达OsmiR156转基因植株，与野生型相比较，在组织器官特异表达D18pro-OsMIR156的转基因株系能够在头季稻成熟期就形成分蘖，而这些提前长出的分蘖对头季稻千粒重等与产量密切相关性状没有明显影响，但可提高再生稻的株高和稻穗长度、增加籽粒充实度，进而提高再生稻产量。

[0017] 实施例1 OsMIR156a～l共12个不同水稻基因的克隆

[0018] 利用在线Primer-BLAST软件针对12个不同OsMIR156a～l基因分别进行上下游引物设计。引物设计时的主要设定或修改参数包括：PCR product size为150-1000bp；Primer melting temperatures(Tm)为55-65℃；Organism设定为Oryza sativa(japonica cultivar-group)(taxid:39947)；Database选择为Refseq representative genomes，其余参数均为系统默认缺省值。引物设定后送华大基因或武汉金开瑞生物公司进行引物合成。

[0019] 采用CTAB法从日本晴、中花11或其他水稻材料中提取DNA，分别以上述方法设计的不同OsMIR156a～l基因对应的合成引物进行PCR扩增，其中PCR反应体系为50μL：DNA模板-11.0μL、正向引物1.0μL、反向引物1.0μL、10μmol·L 的dNTP 1.0μL、10X缓冲液5.0μL、pfu Taq酶0.5μL及双蒸水40.5μL。扩增条件为：94℃3min；94℃30s,58℃(该温度需参考不同引物序列进行设定)30s，72℃1min，35个循环；72℃延伸5min。将扩增的PCR产物经1％的凝胶电泳后，切下含目标片段的凝胶利用试剂盒回收产物，将回收产物利用T4ligase酶连接到由EcoR V酶切后的pBluescriptSK+(pBS)载体片段上得到中间载体。不同基因克隆的主要差异为PCR对应的引物和片段序列，分别如下：

[0020] OsMIR156a基因：利用引物对(5’-AGTCAGGAATTACGAAGGGTGT-3’(SEQ ID No.13)和5’-ACAAGCTAGACCCCTCAAATGT-3’(SEQ ID No.14))，从水稻基因组DNA中克隆包含OsmiR156家族中的OsMIR156a对应的前前体pri-miR156a序列(长度为320bp)。将扩增的PCR产物连接到由EcoR V酶切后的pBluescriptSK+(pBS)载体片段上得到中间载体pBS-OsMIR156a，并送华大基因生物公司进行测序分析，测序结果中的序列与OsMIR156a中包含的对应pre-miR156a的片段完全一致，其序列如SEQ ID No.1所示。

[0021] OsMIR156b基因：利用引物对(5’-TCCGGCCTCATTTCTTGCATA-3’(SEQ ID No.15)和5’-GGAGATGATATTGGCAGGCTCA-3’(SEQ ID No.16))，从水稻基因组DNA中克隆OsmiR156家族中的OsMIR156b对应的前前体pri-miR156b序列(长度为390bp)。将扩增的PCR产物连接到由EcoR V酶切后的pBluescriptSK+(pBS)载体片段上得到中间载体pBS-OsMIR156b，并送华大基因生物公司进行测序分析，测序结果中的序列与OsMIR156b中包含的对应pre-miR156b片段完全一致，其序列如SEQ ID No.2所示。

[0022] OsMIR156c基因：利用引物对(5’-TAGGAGGAAGAGAGGGGTGAG-3’(SEQ ID No.17)和5’-CAAGCATGTATGTGGTTGTGGTT-3’(SEQ ID No.18))，从水稻基因组DNA中克隆OsmiR156家族中的OsMIR156c对应的前前体pri-miR156c序列(长度为313bp)。将扩增的PCR产物连接到由EcoR V酶切后的pBluescriptSK+(pBS)载体片段上得到中间载体pBS-OsMIR156c并送华大基因生物公司进行测序分析，测序结果中的序列与OsMIR156c中包含的对应pre-miR156c片段完全一致，其序列如SEQ ID No.3所示。

[0023] OsMIR156d基因：利用引物对(5’-ACCGGATCCAAGAAGAAAACCT-3’(SEQ ID No.19)和5’-ACCAAGCATAAGGGGTGGTTT-3’(SEQ ID No.20))，从水稻基因组DNA中克隆OsmiR156家族中的OsMIR156d对应的前前体pri-miR156d序列(长度为430bp)。将扩增的PCR产物连接到由EcoR V酶切后的pBluescriptSK+(pBS)载体片段上得到中间载体pBS-OsMIR156d，并送华大基因生物公司进行测序分析，测序结果中的序列与OsMIR156d中包含的对应pre-miR156d片段完全一致，其序列如SEQ ID No.4所示。

[0024] OsMIR156e基因：利用引物对(5’-TTTCATCGTGGGGGTGTGAG-3’(SEQ ID No.21)和5’-GCCTAGAGACTCGGAACAGC-3’(SEQ ID No.22))，从水稻基因组DNA中克隆OsmiR156家族中的OsMIR156e对应的前前体pri-miR156e序列(长度319bp)。将扩增的PCR产物连接到由EcoR V酶切后的pBluescriptSK+(pBS)载体片段上得到中间载体pBS-OsMIR156e并送华大基因生物公司进行测序分析，测序结果中的序列与OsMIR156e中包含的对应pre-miR156e片段完全一致，其序列如SEQ ID No.5所示。

[0025] OsMIR156f基因：利用引物对(5’-CGCCCACCTTTCTTCTCCCA-3’(SEQ ID No.23)和5’-AAGGAGCAGTTAGATAATGGAG-3’(SEQ ID No.24))，从水稻基因组DNA中克隆OsmiR156家族中的OsMIR156f对应的前前体pri-miR156f序列(长度为382bp)。将扩增的PCR产物连接到由EcoR V酶切后的pBluescriptSK+(pBS)载体片段上得到中间载体pBS-OsMIR156f并送华大基因生物公司进行测序分析，测序结果中的序列与OsMIR156f中包含的对应pre-miR156f片段完全一致，其序列如SEQ ID No.6所示。

[0026] OsMIR156g基因：利用引物对(5’-GGCTGACAGAAGAGAGTGAGC-3’(SEQ ID No.25)和5’-GAGATGGATGGACGGATGGAC-3’(SEQ ID No.26))，从水稻基因组DNA中克隆OsmiR156家族中的OsMIR156g对应的前前体pri-miR156g序列(长度为189bp)。将扩增的PCR产物连接到由EcoR V酶切后的pBluescriptSK+(pBS)载体片段上得到中间载体pBS-OsMIR156g并送华大基因生物公司进行测序分析。测序结果中的序列与OsMIR156g中包含的对应pre-miR156g片段完全一致，其序列如SEQ ID No.7所示。

[0027] OsMIR156h基因：利用引物对(5’-CTTGTCCTCGGTCAGAGAGC-3’(SEQ ID No.27)和5’-TCTCTCGCTCCTATGTGGCT-3’(SEQ ID No.28))，从水稻基因组DNA中克隆OsmiR156家族中的OsMIR156h对应的前前体pri-miR156h序列(长度为496bp)。将扩增的PCR产物连接到由EcoR V酶切后的pBluescriptSK+(pBS)载体片段上得到中间载体pBS-OsMIR156h并送华大基因生物公司进行测序分析。测序结果中的序列与OsMIR156h中包含的对应pre-miR156h片段完全一致，其序列如SEQ ID No.8所示。

[0028] OsMIR156i基因：利用引物对(5’-ATGATAAGAGCACCCGGACG-3’(SEQ ID No.29)和5’-CATCTCAAAGCGGTGTTCGC-3’(SEQ ID No.30))，从水稻基因组DNA中克隆OsmiR156家族中的OsMIR156i对应的前前体pri-miR156i序列(长度为356bp)。将扩增的PCR产物连接到由EcoR V酶切后的pBluescriptSK+(pBS)载体片段上得到中间载体pBS-OsMIR156i并送华大基因生物公司进行测序分析。测序结果中的序列与OsMIR156i中包含的对应pre-miR156i片段完全一致，其序列如SEQ ID No.9所示。

[0029] OsMIR156j基因：利用引物对(5’-CGGAGATGAGAGATCGACGC-3’(SEQ ID No.31)和5’-ACCGGATCCGAGAAGCAAAG-3’(SEQ ID No.32))，从水稻基因组DNA中克隆OsmiR156家族中的OsMIR156j对应的前前体pri-miR156j序列(长度为290bp)。将扩增的PCR产物连接到由EcoR V酶切后的pBluescriptSK+(pBS)载体片段上得到中间载体pBS-OsMIR156j并送华大基因生物公司进行测序分析。测序结果中的序列与OsMIR156j中包含的对应pre-miR156j片段完全一致，其序列如SEQ ID No.10所示。

[0030] OsMIR156k基因：利用引物对(5’-CGAGATGGACGGCAATGACA-3’(SEQ ID No.33)和5’-TGCATCGTGAGTCTAGTCTGT-3’(SEQ ID No.34))，从水稻基因组DNA中克隆OsmiR156家族中的OsMIR156k对应的前前体pri-miR156k序列(长度为257bp)。将扩增的PCR产物连接到由EcoR V酶切后的pBluescriptSK+(pBS)载体片段上得到中间载体pBS-OsMIR156k，并送华大基因生物公司进行测序分析。测序结果中的序列与OsMIR156k中包含的对应pre-miR156k片段完全一致，其序列如SEQ ID No.11所示。

[0031] OsMIR156l基因：利用引物对(5’-ACAAAAGAGCTAGGGAGCCG-3’(SEQ ID No.35)和5’-TTCGCCACTGATGTGAACCA-3’(SEQ ID No.36))，从水稻基因组DNA中克隆OsmiR156家族中的OsMIR156l对应的前前体pri-miR156l序列(长度为630bp)。将扩增的PCR产物连接到由EcoR V酶切后的pBluescriptSK+(pBS)载体片段上得到中间载体pBS-OsMIR156l，并送华大基因生物公司进行测序分析。测序结果中的序列与OsMIR156l中包含的对应pre-miR156l片段完全一致，其序列如SEQ ID No.12所示。

[0032] 实施例2 组织器官特异表达启动子序列克隆

[0033] 茎杆特异表达型启动子选优采用OsGA3ox2基因的启动子。将OsGA3ox2基因的长约2.1Kb的启动子(简称D18启动子)，其中D18启动子序列相关信息参考文献报道(Sakamoto T,Morinaka Y,Ishiyama K,Kobayashi M,Itoh H,Kayano T,Iwahori S,MatsToka M,Tanaka H.Genetic manipulation of gibberellin metabolism in transgenic rice.Nat Biotechnology.2003,21:909-913)。利用该参考文献中记载的PCR方法获得片段后连接到由EcoR V酶切后的pBluescriptSK+(pBS)载体片段上得到中间载体pBS-D18p，送华大基因生物公司进行测序分析，测序结果显示与已知序列完全一致，采用HindⅢ/BamH I酶切pBS-D18p质粒，回收酶切产物，获得D18p启动子。

[0034] 实施例3 构建12个茎杆特异表达载体pWM-D18p-OsMIR156a～l(简称为D18Pro-OsMIR156a～l)

[0035] 分别采用HindⅢ/sal I酶切载体pWM101、BamH I/sal I酶切中间载体pBS-OsMIR156a～l后，将所需酶切片段产物分别回收，并利用T4ligase与D18p启动子进行三片段连接，连接体系为：HindⅢ/sal I酶切载体pWM101产物1.0μl、HindⅢ/BamH I酶切pBS-D18p质粒1.0μl、BamH I/sal I酶切中间载体pBS-OsMIR156a～l 1.5μl、5×T4ligase Buffer 1.0μl及T4ligase 0.5μl，将上述反应连接体系置于16℃保持30min或置于4℃过夜。然后采用常规的分子试验方法转化连接产物于感受态大肠杆菌的菌株，并利用Kan+抗性筛选，获得12个不同载体pWM-D18p-OsMIR156a～l。

[0036] 实施例4 茎杆特异表达载体pWM-D18p-OsMIR156a～l的转化

[0037] 1.水稻成熟胚愈伤组织的诱导：将水稻稻谷(日本晴或中花11)人工去颖壳后依次用3％的次氯酸钠与70％的酒精消毒后，置于含2.0mg/L 2,4-D的N6固体培养基上，诱导10～14天以获得胚性愈伤组织。

[0038] 2.含转化载体菌液的培养与制备：将前面获得的12个pWM-D18p-OsMIR156a～l载体中的任意一个或多个表达载体转化到根癌农杆菌EHA105菌株中，然后从含有卡那霉素和利福平的固体筛选培养基上挑选单菌落放入相同抗生素的YEB液体培养基中，28℃、200～250rpm/min过夜培养至OD600值约为0.8，4000～5000rpm/min离心后弃上清，用AB液体培养基重悬沉淀。

[0039] 3.将诱导的胚性愈伤组织用解剖刀从外植体上剥离后，用制备好的含转化载体的菌液侵染胚性愈伤组织10～30min，将愈伤组织转移到无菌滤纸上吸干水分，转入含100μM的乙酰丁香酮的N6培养基上培养3天。

[0040] 4.用无菌水将愈伤组织清洗干净后转入含有25～50mg/L潮霉素与200～400mg/L羧变青霉素钠的N6固体培养基上筛选1～3周，将得到的抗性愈伤组织转入新的培养基(含有25～50mg/L潮霉素与200～400mg/L羧变青霉素钠的N6固体培养基)中继续筛选2～3周，再将抗性愈伤组织转入MS培养基进行分化、生根培养，获得转化植株(T1代转化植株)，将其移栽盆钵中按常规技术进行水稻栽培管理。

[0041] 实施例5 功能验证

[0042] 将盆钵栽培的T1代转化植株按单株取水稻叶片，采用CTAB法提取DNA样品，利用所携带的潮霉素抗性基因序列对应的引物

[0043] 5’-ACGGTGTCGTCCATCACAGTTTGCC-3’(SEQ ID No.37)与

[0044] 5’-TTCCGGAAGTGCTTGACATTGGGGA-3’(SEQ ID No.38)进行PCR检测分析，能够检测到阳性条带的即为T1代转基因株系，按单株收集种子进行后续试验。

[0045] 分别将转基因株系材料(D18p-OsMIR156a～l)及野生型对照材料(wild-type)在盆钵中进行单本种植，分别比较头季稻成熟期时水稻基部分蘖芽生长性状，再生稻稻穗长短、千粒重等产量相关性状，在本实施例中以转化pWM-D18p-OsMIR156f载体为例，结合参见图1和图2及下表1。从转基因材料中挑选出再生稻稻穗长度长、产量优于野生型再生稻的转基因株系材料。

[0046] 表1组织器官特异启动子驱动OsMIR156f转化水稻产量相关性状的变化特性[0047]

[0048]

[0049] 注:表中数据均为4-10个不同株系的均值±误差。

[0050] 由上可知，利用特异启动子过表达OsmiR156转基因植株，与野生型相比较，在组织器官特异表达D18pro-OsMIR156f的转基因株系能够在头季稻成熟期就形成分蘖，而这些提前长出的分蘖对头季稻千粒重等性状没有明显影响，但可提高再生稻的株高和稻穗长度、增加籽粒充实度，进而提高再生稻产量。

[0013] 图1是组织器官特异启动子驱动OsMIR156f转化水稻表型，能提前形成再生稻分蘖。

[0014] 图中，1：野生型水稻；2：组织器官特异表达OsMIR156f基因植株头季稻成熟期形成再生稻分蘖。

[0015] 图2是组织器官特异启动子驱动OsMIR156f转化水稻后对再生稻农艺性状的影响。

[0016] 图中，1：野生型水稻；2：组织器官特异表达OsMIR156f基因水稻。