[0037] 下面结合附图和具体实施例进一步详细说明本发明。除非特别说明,实施例中采用的试剂和方法为本领域常规使用的试剂和方法。
[0038] 实施例1:
[0039] S1.对外植体进行短期细胞分裂素溶液处理的容器的准备
[0040] 选取直径为9 cm的有盖培养皿,置于高压蒸汽灭菌锅中,在121℃,0.1 MPa的条件下灭菌20 min。
[0041] S2.苯基噻二唑基脲(TDZ)处理溶液的配制。
[0042] 准确称取一定量的TDZ粉末,用1 mol/l NaOH溶液充分溶解,再用去离子水定容,配制成0、10、20、30、40、50、60 mg/l的TDZ处理溶液(对照组0 mg/l TDZ溶液为无菌去离子水)。采用1 mol/l HCl溶液调整TDZ处理溶液的pH至5.8~6.0;使用前用0.22微米的水系滤膜对已配制好的TDZ处理溶液进行过滤灭菌。
[0043] S3.麻疯树无菌下胚轴外植体的获取
[0044] 将浸泡了2天的麻疯树种子去壳,经过0.1% 升汞溶液灭菌后,在超净工作台中用无菌手术刀剥离胚胎,将剥离的胚胎接种至经过高温蒸汽灭菌的MS培养基(MS配方成分+30 g/l蔗糖+100 mg/l肌醇+6 g/l琼脂;pH5.8-6.0)上,培养12天后,获取种子苗上的下胚轴,用无菌手术刀将下胚轴切成长度约为0.5 cm的下胚轴切段,即可作为无菌下胚轴外植体。
[0045] S4.细胞分裂素(TDZ)溶液处理麻疯树种子苗下胚轴外植体
[0046] 在超净工作台中,把切好的无菌下胚轴外植体分别置于上述步骤S1准备好的灭过菌的培养皿中,向各个培养皿中分别倒入上述步骤S2配置的各个浓度的TDZ处理溶液至浸没叶柄外植体为止,盖上培养皿盖,静置20 min后,倒掉TDZ溶液,保留无菌下胚轴,用灭过菌的镊子从培养皿中取出所有的无菌下胚轴外植体,放置在无菌吸水纸上,吸去无菌下胚轴外植体表面多余的水分,每个浓度的TDZ溶液分别有3个平行处理。
[0047] S5.将切好的无菌下胚轴外植体置于细胞分裂素(TDZ)溶液处理的容器中,向该容器的广口玻璃瓶中倒入不同浓度的TDZ溶液(0、10、20、30、60 mg/l)至浸没所有的无菌下胚轴外植体为止(对照组0 mg/l TDZ溶液为无菌去离子水),盖上瓶盖,静置20 min后,倒掉TDZ溶液,保留下胚轴,用灭过菌的镊子从广口玻璃瓶中取出所有的无菌下胚轴外植体,放置在无菌吸水纸上,吸去下胚轴外植体表面多余的液体,最后把处理后的无菌下胚轴外植体以横放方式(将下胚轴外植体放置在培养基上,使下胚轴外植体与培养基表面轻轻接触,并且使下胚轴外植体的横切面与培养基的水平表面相垂直)接种在无激素MS培养基(MS配方成分+30 g/l蔗糖+100 mg/l肌醇+6 g/l琼脂;pH5.8~6.0)上培养35天,所获得实验结果如表1和图1所示。
[0048] 表1不同浓度的TDZ溶液浸泡处理麻疯树无菌下胚轴外植体诱导不定芽直接再生的效果
[0049]
[0050] 注:数据采用SPSS Statistics 17.0统计分析软件进行方差分析和邓肯多重比较(P ≦ 0.05),数据后字母不同表示处理间差异显著。再生率(%)=(再生出不定芽的外植体数/总外植体数)× 100%;平均每个外植体的芽数(颗)=再生不定芽总数/再生出不定芽的外植体数。
[0051] 从表1中可知,未用TDZ溶液处理的无菌下胚轴外植体没有不定芽产生,而用不同浓度TDZ溶液处理的无菌下胚轴外植体均能再生出不定芽,但不同浓度TDZ溶液处理诱导无菌下胚轴外植体再生不定芽的频率和每个外植体的平均再生芽数多表现显著差异。此外,随着TDZ浓度的增加,不定芽再生率和平均每个无菌下胚轴外植体的再生芽数表现出先增加后降低的趋势;其中TDZ溶液浓度为20 mg/l时,不定芽的再生率和平均每个外植体的芽数均为最高,分别为81.91%和10.16颗。
[0052] 同时,采用传统方法诱导麻疯树无菌下胚轴外植体不定芽再生:把切好的下胚轴外植体直接以横放方式(将下胚轴外植体放置在培养基上,使下胚轴外植体与培养基表面轻轻接触,并且使下胚轴外植体的横切面与培养基的水平表面相垂直)接种于添加了不同浓度TDZ(0、0.1、0.3、0.6、1.2 mg/l)的MS培养基上培养35天(对照组0 mg/l TDZ溶液为无菌去离子水),所获得实验结果如表2所示。
[0053] 表2采用传统方法诱导麻疯树无菌下胚轴外植体不定芽再生
[0054]
[0055] 注:数据采用SPSS Statistics 17.0统计分析软件进行方差分析和邓肯多重比较(P ≦ 0.05),数据后字母不同表示处理间差异显著。再生率(%)=(再生出不定芽的外植体数/总外植体数)× 100%;平均每个外植体的芽数(颗)=再生不定芽总数/再生出不定芽的外植体数。
[0056] 从表2可知,当添加的TDZ浓度为1.2 mg/l时,不定芽再生率和平均每个外植体的芽数均为最高,分别为30.97%和3.03颗。
[0057] 综上所述,由两个表中的数据可知,采用短期高浓度TDZ浸泡处理麻疯树无菌下胚轴外植体的不定芽再生效果显著优于采用传统方法的效果。
[0058] 按照实施例所述高浓度TDZ处理得到的无菌下胚轴外植体再生不定芽在不定芽伸长培养基(MS配方成分+30 g/l蔗糖+100 mg/l肌醇+0.5 mg/l BA(苄氨基腺嘌呤)+0.2 mg/l KT(激动素)+0.4 mg/l GA3(赤霉素)+0.2 mg/l IAA(吲哚乙酸)+10 mg/l精氨酸+5 g/l琼脂;pH5.8~6.0)上培养15天后,可获得较多生长状态良好的再生不定芽芽条,结果见图2。
[0059] 实施例2 TDZ溶液浸泡处理麻疯树无菌下胚轴外植体的时间对直接再生不定芽效果的影响
[0060] S1.对外植体进行短期细胞分裂素溶液处理的容器的准备:同实施例1。
[0061] S2.配置20 mg/l的苯基噻二唑基脲(TDZ)溶液:同实施例1。
[0062] S3.麻疯树无菌下胚轴外植体的获取:同实施例1
[0063] S4.细胞分裂素(TDZ)溶液处理麻疯树无菌下胚轴外植体:将切好的无菌下胚轴外植体置于细胞分裂素(TDZ)溶液处理的容器中,向该容器的广口玻璃瓶中倒入浓度为20 mg/l的TDZ溶液至浸没所有的下胚轴外植体为止(对照组0 mg/l TDZ溶液为无菌去离子水),盖上瓶盖,对下胚轴外植体进行不同时间(0、5、20、40 min)的TDZ溶液浸泡处理后,倒掉TDZ溶液,保留下胚轴外植体,用灭过菌的镊子从广口玻璃瓶中取出所有的下胚轴外植体,放置在无菌吸水纸上,吸去下胚轴外植体表面多余的液体,最后把处理后的下胚轴外植体以横放方式(将下胚轴外植体放置在培养基上,使下胚轴外植体与培养基表面轻轻接触,并且使下胚轴外植体的横切面与培养基的水平表面相垂直)接种在无激素MS培养基(MS配方成分+30 g/l蔗糖+100 mg/l肌醇+6 g/l琼脂;pH5.8~6.0)上培养35天,所获得实验结果如表3所示。
[0064] 表3 TDZ溶液浸泡处理时间对麻疯树无菌下胚轴外植体直接再生不定芽的影响[0065]
[0066] 注:数据采用SPSS Statistics 17.0统计分析软件进行方差分析和邓肯多重比较(P ≦ 0.05),数据后字母不同表示处理间差异显著。再生率(%)=(再生出不定芽的外植体数/总外植体数)× 100%;平均每个外植体的芽数(颗)=再生不定芽总数/再生出不定芽的外植体数。
[0067] 从表3中可知,随着浸泡处理无菌下胚轴外植体的时间增加,不定芽再生率和平均每个外植体的再生芽数表现出先增加后降低的趋势,以浸泡时间为20 min时的不定芽再生效果最佳。
[0068] 实施例3
[0069] S1.对外植体进行短期细胞分裂素溶液处理的容器的准备:同实施例1。
[0070] S2.配置20 mg/l的苯基噻二唑基脲(TDZ)溶液,具体配置方法同实施例1。
[0071] S3.麻疯树无菌下胚轴外植体和种子苗下胚轴外植体的获取:具体方法同实施例1。
[0072] S4.细胞分裂素(TDZ)溶液分别处理麻疯树无菌下胚轴外植体和种子苗下胚轴外植体:将切好的2种类型的下胚轴外植体置于细胞分裂素(TDZ)溶液处理的容器中,向该容器的广口玻璃瓶中倒入浓度为20 mg/l的TDZ溶液至浸没所有的下胚轴外植体为止,盖上瓶盖,对下胚轴外植体进行20 min的浸泡处理后,倒掉TDZ溶液,保留下胚轴外植体,用灭过菌的镊子从广口玻璃瓶中取出所有的下胚轴外植体,放置在无菌吸水纸上,吸去下胚轴外植体表面多余的液体,最后把处理后的下胚轴外植体以两种放置方式(横放方式:将下胚轴外植体放置在培养基上,使下胚轴外植体与培养基表面轻轻接触,并且使下胚轴外植体的横切面与培养基的水平表面相垂直。竖插方式:将下胚轴外植体放置在培养基上,使得下胚轴外植体的中轴与培养基表面相垂直,下胚轴外植体插入培养基中的深度为0.1~0.2 cm。)接种在无激素MS培养基(MS配方成分+30 g/l蔗糖+100 mg/l肌醇+6 g/l琼脂;pH5.8~6.0)上培养35天,所得实验结果如表4所示。
[0073] 表4 下胚轴外植体接种放置方式对不定芽再生效果的影响
[0074]
[0075] 注:数据采用SPSS Statistics 17.0统计分析软件进行方差分析和邓肯多重比较(P ≦ 0.05),数据后字母不同表示处理间差异显著。再生率(%)=(再生出不定芽的外植体数/总外植体数)× 100%;平均每个外植体的芽数(颗)=再生不定芽总数/再生出不定芽的外植体数。外植体来源1为来源于麻疯树去壳种子的胚胎在无菌的MS培养基上培养12天后获取的无菌下胚轴外植体;外植体来源2为来源于疯树种子在培养基质(土:沙砾=1:1)上以自然条件培养12天后获取的种子苗下胚轴外植体。
[0076] 从表4中的数据可知,无论是哪种来源的下胚轴外植体,采用横放方式接种的外植体不定芽再生效果均显著优于竖插方式的再生效果。而种子苗下胚轴外植体不定芽再生率仅为25.70%,因此不适宜采用苯基噻二唑基脲溶液浸泡处理的方法来诱导种子苗下胚轴外植不定芽再生。
[0077] 实施例4
[0078] 分别参考实施例1、2和3的步骤,研究不同浓度TDZ溶液处理成年植株叶片外植体、无菌子叶叶片外植体、种子苗下胚轴外植体、无菌子叶叶柄外植体和真叶叶柄外植体的不定芽再生的情况。
[0079] 由结果得知:成年植株叶片外植体、无菌子叶叶片外植体最适合的TDZ溶液的浓度为20 mg/l,处理时间为40 min;无菌子叶叶柄外植体和真叶叶柄外植体最适合的TDZ溶液的浓度为20 mg/l,处理时间为20 min。而种子苗下胚轴外植体不适宜采用高浓度TDZ溶液短期浸泡处理的方法来诱导不定芽再生。
[0080] 实施例5:不同接种方式对麻疯树两种类型叶柄外植体再生不定芽效率的影响[0081] 本实施例所述的两种类型叶柄外植体分别为无菌子叶叶柄外植体和真叶叶柄外植体。无菌子叶叶柄外植体来源于自然萌发种子苗真叶叶柄;真叶叶柄外植体来源于无菌萌发种子苗子叶叶柄。
[0082] 将切好的2种类型的叶柄外植体置于细胞分裂素(TDZ)溶液处理的容器中,向该容器的广口玻璃瓶中倒入浓度为20 mg/l的TDZ溶液至浸没所有的叶柄外植体为止,盖上瓶盖,对叶柄外植体进行20分钟的浸泡处理后,倒掉TDZ溶液,保留叶柄外植体,用灭过菌的镊子从广口玻璃瓶中取出所有的叶柄外植体,放置在无菌吸水纸上,吸去叶柄外植体表面多余的液体,最后把处理后的叶柄外植体以两种放置方式(横放方式:将叶柄外植体放置在培养基上,使叶柄外植体与培养基表面轻轻接触,并且使叶柄外植体的横切面与培养基的水平表面相垂直。竖插方式:将叶柄外植体放置在培养基上,使得叶柄外植体的中轴与培养基表面相垂直,叶柄外植体的形态学下端插入培养基中的深度为0.1~0.2 cm。)接种在无激素MS培养基(MS配方成分+30 g/l蔗糖+100 mg/l肌醇+6 g/l琼脂;pH5.8~6.0)上培养35天,所得实验结果如表5和图4所示。
[0083] 表5 叶柄外植体接种放置方式对不定芽再生效果的影响
[0084]
[0085] 注:数据采用SPSS Statistics 17.0统计分析软件进行方差分析和邓肯多重比较(P ≦ 0.05),数据后字母不同表示处理间差异显著。再生率(%)=(再生出不定芽的外植体数/总外植体数)× 100%;平均每个外植体的芽数(颗)=再生不定芽总数/再生出不定芽的外植体数。
[0086] 从表5中的数据可知,无论是哪种类型的叶柄外植体,采用横放接种方式的不定芽再生效果均显著优于竖插方式的效果。
[0087] 2种类型的叶柄外植体再生不定芽在不定芽伸长培养基(MS配方成分+30 g/l蔗糖+100 mg/l肌醇+0.5 mg/l BA(苄氨基腺嘌呤)+0.2 mg/l KT(激动素)+0.4 mg/l GA3(赤霉素)+0.2 mg/l IAA(吲哚乙酸)+10 mg/l精氨酸+5 g/l琼脂;pH5.8~6.0)上培养15天后,可获得较多生长状态良好的再生不定芽芽条,结果见图5。
[0088] 实施例6:不同接种方式对2种类型麻疯树叶片外植体再生不定芽效率的影响[0089] 本次实验,选用如说明书c中所述经表面灭菌后成年树龄的麻疯树茎顶端叶片和无菌条件下培养12天的种子苗上的子叶叶片为实验材料,在超净工作台中用无菌手术刀将叶片切成大小约为0.5×0.5 cm的叶片小块作为外植体,将切好的叶片外植体置于细胞分裂素溶液处理的容器中,向该容器的广口玻璃瓶中倒入浓度为20 mg/l的TDZ溶液至浸没所有的叶片外植体为止,盖上瓶盖,对叶片外植体进行40 min的TDZ溶液浸泡处理后,倒掉TDZ溶液,保留叶片,用灭过菌的镊子从广口玻璃瓶中取出所有的叶片外植体,放置在无菌吸水纸上,吸去叶片外植体表面多余的液体,最后把处理后的叶片外植体以两种放置方式接种(使得叶片外植体的下表面朝上,其上表面与培养基表面接触;使得叶片外植体的上表面朝上,其下表面与培养基表面接触)在无激素MS培养基上培养35天,所获得实验结果如表6和图6所示。
[0090] 表6 叶片外植体的接种方式对不定芽再生效果的影响
[0091]
[0092] 注:数据采用SPSS Statistics 17.0统计分析软件进行方差分析和邓肯多重比较(P ≦ 0.05),数据后字母不同表示差异显著。
[0093] 再生率(%)=(再生出不定芽的外植体数/总外植体数)× 100%;平均芽数(颗)=再生不定芽总数/出芽的总外植体数。
[0094] 从表6的数据可知,对麻疯树叶片外植体进行再生不定芽培养时,采用叶片下表面朝上的接种放置方式的再生不定芽的效果明显优于采用上表面朝上的接种放置方式的效果。
[0095] 叶片外植体再生不定芽在不定芽伸长培养基(MS配方成分+30 g/l蔗糖+100 mg/l肌醇+0.5 mg/l BA(苄氨基腺嘌呤)+0.2 mg/l KT(激动素)+0.4 mg/l GA3(赤霉素)+0.2 mg/l IAA(吲哚乙酸)+10 mg/l精氨酸+5 g/l琼脂;pH5.8~6.0)上培养15天后,可获得较多生长状态良好的再生不定芽芽条。无菌苗子叶叶片在不定芽伸长培养基培养15天后的结果见图7。