[0036] 下面结合附图和具体实施例进一步详细说明本发明。
[0037] 实施例1
[0038] (1)单根结DNA的获得
[0039] 播种番茄(夏红一号)、青瓜(新万吉)和蕹菜25天后移苗至直径15cm的装有灭菌土的花盆中，每盆1株。移苗一周后，每株分别接种200条象耳豆根结线虫、南方根结线虫、爪哇根结线虫和花生根结线虫的2龄幼虫(J2)，同时保留不接虫的健康植株作为对照，置于光照培养室14h光照，10h黑暗条件下25℃恒温培养。分别于接种后5d、10d、15d、20d、25d、30d染色观察线虫形态。同时提取健康根组织DNA和单根结DNA，每个处理取5个重复，设1个空白对照。
[0040] 根部组织染色及不同时期线虫形态观察，步骤如下：
[0041] (1)洗净根组织，放入150ml的烧杯中；
[0042] (2)加入50ml蒸馏水，并加入适量的5.25％(体积比浓度)的次氯酸钠(30～50ml)；
[0043] (3)用玻璃棒不断搅拌杯内根部组织；
[0044] (4)4min后取出根组织用清水洗45s，然后在ddH2O内浸泡15min；
[0045] (5)倒出水，将根组织移入另一个装有30～50ml ddH2O的烧杯中，加入1ml酸性品红溶液；
[0046] (6)水浴或微波炉将组织液煮沸30s，(幼根反复煮沸2～3次；老根煮沸2～3min)；
[0047] (7)冷却后用水漂洗根组织，4倍镜下测量根结直径，然后解剖镜下压片镜检观察线虫形态并计数。
[0048] 单根结样品制备：对接种2个南方根结线虫种群(GNs和ZCdg)，2个爪哇根结线虫种群(GNk和ZCf)，1个花生根结线虫种群(YZy)和4个象耳豆根结线虫种群(PY1，HYz，GNj和GNc)的黄瓜(附图1)、番茄(附图2)、蕹菜(附图3)分别于5d、10d、15d、20d、25d、30d用NaOH裂解的方法提取单根结DNA，同时设一个不接虫的健康根组织DNA作为阴性对照，每棵根取10个根结。提取时，将单个根结放入加了45μl 50mM NaOH的离心管中，用研磨杵捣碎后以最大速度水平振荡3～5min，短暂离心后95℃水浴10min，然后加入5μl 1M Tris-HCl(pH8.0)，混匀，12,000g离心30sec，直接PCR或-20℃保存备用。
[0049] 实施例2
[0050] (2)合成引物
[0051] 根据植物线虫大亚基核糖体DNA(基因登录号为：AF435803、AF435794、AY446970、JN005857、FN429017、GQ375158、EU364890、EU570214、AF435793、AF435802、FJ485651、DQ328713、HQ688681、EU130893和EU36859)的D2D3区设计线虫通用引物MF和MR；根据根结线虫mtDNA COII和lrRNA基因(基因登录号为：FJ159631、AY635612、GQ266686、GQ266685、AY446970、GQ870255、AY757882、GQ865513、HM161680、AY635609、AY757909、AY942848、AY942851和EU364883)间区域种间差异进行设计象耳豆根结线虫的特异引物FMe和Rme。
[0052] 所述引物的核苷酸序列如下：
[0053] MF 5’-GGGGATGTTTGAGGCAGATTTGT-3’；
[0054] MR 5’-AACCGCTTCGGACTTCCACCAG-3’；
[0055] FMe 5’-CATTCATTTATACCAATTTTAGTTGAGG-3’；
[0056] RMe 5’-CAATTATTGAATATTTTTTCCCAAACGA-3’。
[0057] 引物的特异性检测：先进行BLAST(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast)网上比对，发现引物对FMe/RMe只和象耳豆根结线虫和玛雅古根结线虫(GQ870255，FJ159613，FJ159617，AY831967，AY446969-AY446978，AY757907，AY635613 和AJ421396)有100％的相似性，而通用引物对MF/MR和M.arenaria(AF435803，U42339和 U42342)，M.fallax(FN429017)，M.hispanica(GQ375158 和 EU443606-EU443608)，M.thailandica(EU364890)，M.silvestris(EU570214)，M.dunensis(EF612712)，M.exigua(AF435795，AF435796 和 AF435804)，M.paranaensis(AF435798-AF435780)，M.graminicola(AF435793)，M.konaensis(AF435797)，M.chitwoodi(AF435802) 和M.trifoliophila(AF435801)有100％的相似性。
[0058] 分别采用根结线虫通用引物MF/MR和象耳豆根结线虫的特异引物FMe/RMe进行PCR扩增以检测引物的特异性。
[0059] PCR反应体系为：10ng模板DNA(提取自根结线虫的J2)，上下游引物各0.2μM，0.2mM dNTPs，含2mM MgCl2的1×PCR缓冲液，1U Taq DNA聚合酶和余量ddH2O，共25μl。
[0060] PCR条件为：预变性94℃2min；94℃变性30s，退火30s(FMe/RMe 64℃，MF/MR59℃)和72℃30s，共30循环；终延伸72℃10min。
[0061] 将5μl PCR产物用1％琼脂糖电泳分离，结果表明引物对MF/MR扩增南方根结线虫、爪哇根结线虫、花生根结线虫和象耳豆根结线虫的不同种群均可得到478bp大小的条带，扩增北方根结线虫得到481bp大小的条带，扩增拟禾本科根结线虫(M.graminicola)和禾本科根结线虫(M.graminis)均得到485bp大小的条带，而用作对照的其他植物寄生线虫和秀丽小杆线虫(C.elegans)均没有条带产生。
[0062] 引物对FMe/RMe只可扩增象耳豆根结线虫不同种群得到194bp大小的条带，而其他根结线虫，植物寄生线虫以及秀丽小杆线虫均没有条带产生。此结果说明所设计引物具有高度特异性。
[0063] (3)双重PCR扩增反应体系的建立
[0064] 分别采用根结线虫通用引物MF/MR和象耳豆根结线虫的特异引物FMe/RMe进行双重PCR扩增以检测象耳豆根结线虫，DNA模板来自根结线虫的J2。按下列体系配置PCR反应体系：
[0065] 2×PCR buffer 12.5μl；dNTPs(2mmol/L)5μl；MF(10μmol/L)0.2μl；MR(10μmol/L)0.2μl；FMe(10μmol/L)0.6μl；RMe(10μmol/L)0.6μl；KOD Fx 0.5U；
DNA模板(提取自单条J2)1.0μl；余量ddH2O，共25μl。
[0066] 双重PCR反应条件如下：94℃预变性2min，30个循环94℃变性30sec，64℃退火30sec，68℃延伸30sec，最后72℃后延伸5min。PCR反应可在TaKaRa TP600PCR仪上完成。
然后用2.0％琼脂糖凝胶加样5μlPCR产物电泳，紫外灯下观察，用凝胶成像分析系统照像。
[0067] 电泳结果见附图4所示，其中1～3为不同南方根结线虫种群，4～6为爪哇根结线虫不同种群，7～9为花生根结线虫不同种群，10～15为象耳豆根结线虫不同种群，16～17为两个北方根结线虫种群，18为拟禾本科根结线虫，19为禾本科根结线虫，20～27分别为咖啡短体线虫、肾形肾状线虫、半穿刺线虫、相似穿孔线虫、大豆孢囊线虫、水稻潜根线虫、腐烂茎线虫，秀丽小杆线虫，28为清水对照。结果表明该双重PCR体系特异性好。
[0068] (4)双重PCR扩增单根结DNA
[0069] 除PCR循环数为40循环和模板DNA为4.0μl外，其余反应体系和反应条件同前述“双重PCR扩增反应体系的建立”所述。采用通用引物MF/MR以及象耳豆根结线虫的特异性引物FMe/RMe对分别接种了4个不同象耳豆根结线虫种群的黄瓜、番茄、蕹菜单根结DNA进行双重PCR扩增。同时以接种南方根结线虫、爪哇根结线虫和花生根结线虫的单根结DNA作为对照，并设一段不接虫的健康根组织DNA作为阴性对照。扩增结果表明：接种在黄瓜和番茄上的4个象耳豆根结线虫种群在5d、10d、15d时有62.5％，77.5％and 92.5％的单根结可以成功扩增到478bp和194bp两条电泳条带，接种在蕹菜上的4个象耳豆根结线虫种群在5d、10d、15d时有12.5％，50％and 77.5％的单根结可以成功扩增到478bp和194bp两条电泳条带。接种20d以后一直到30d，三种寄主植物上所有象耳豆根结线虫形成的根结都可以成功扩增到478bp和194bp两条带，见附图5～附图7所示。附图中，1、2代表南方根结线虫不同种群，3、4代表爪哇根结线虫不同种群，5代表花生根结线虫，6～10代表象耳豆根结线虫不同种群，11为健康根阴性对照，12为清水对照。结果表明该双重PCR体系可直接检测含象耳豆根结线虫的单根结。
[0070] 实施例2象耳豆根结线虫单根结快速检测方法的田间应用
[0071] 对采自海南、广东等地的根结线虫新鲜病根样品，首先用雌虫或者二龄幼虫mtDNA-PCR-RFLP确定线虫种类，然后用0.52％的次氯酸钠将病根组织表面消毒。取幼嫩近圆形的单个根结放入含45μl 50mM NaOH的离心管中，用研磨杵捣碎后以最大速度水平振荡3～5min，快速离心后95℃水浴10min，然后加入5μl 1M Tris-HCl(pH8.0)，混匀，12,000g离心30s，取4μl上清液直接进行双重PCR检测，反应条件同前述“双重PCR扩增单根结DNA”所述。检测结果见附图8，附图8中，1～11为田间不同根结样品，Ck-为清水对照。结果表明：1～7泳道的样品双重PCR产生一条478bp大小的根结线虫的通用带和一条194bp大小的象耳豆根结线虫的特异带，说明1～7号样品中含有象耳豆根结线虫，8～
11泳道的样品只产生了一条根结线虫约478bp大小的条带，证明了这四个样品都不是象耳豆根结线虫。通用条带的产生可以避免假阴性扩增结果的发生，有效防止结果判断错误。通过形态学和mtDNA-PCR-RFLP结果同样表明1～7泳道的样品为象耳豆根结线虫，而8～10泳道的样品为南方根结线虫，11泳道的样品为爪哇根结线虫。单根结双重PCR的检测结果同形态学和mtDNA-PCR-RFLP验证结果一致，充分说明象耳豆根结线虫单根结双重PCR检测方法的灵敏度和可信度以及准确性。
