[0014] 下面结合实施例对本发明做进一步阐述:
[0015] 其中所述的灵芝白果酒功能性成分按下列方法测定:称取灵芝银杏白果总黄酮含量的测定采用亚硝酸钠-硝酸铝法(邓斌, 蒋刚彪, 陈六平.分光光度法测定食品包装纸用紫甘薯总黄酮的含量.包装工程,2008,29(1):27~29.);萜类含量的测定采用王翔飞介绍的测定方法(王翔飞,潘旭东,刘雯霞,等.黄花瓦松中总三萜成分的含量的测定.中国民族民间医药,2009,18(10):11.);银杏内酯含量测定采用分光光度法(张渝阳,王鑫, 赵丽娟,荀绍馨,田明,张新,王晓宁,邓桂春:分光光度法测定银杏萜内酯的含量.辽宁化工,2006,35(10):618~620);蛋白质含量测定采用考马斯亮蓝(陈建勋、王晓峰:植物生理学实验指导.实验19:考马斯亮蓝G-250法测定蛋白质含量.华南理工大学出版社p54~55):氢氰酸含量测定依据中华人民共和国国家标准GB/T15665-1995:豆类、配糖氢氰酸含量的测定;银杏酚酸采用荧光分析法测定(田亚平,尤文元,李彧娜,荧光分析法测定银杏酚酸. 分析化学研究简报.2006年特刊,s155-s157),灵芝酸测定采用紫外分光光度法(Tang YJ, Zhong JJ. Fed-batch fermentation of Ganoderma lucidum for hyperproduction of polysaccharide and ganoderic acid. Enzyme and Microbial Technology 31 (2002) 20–28)。
[0016] 本发明中实施例1~3中所使用的灵芝菌种为可以购买到的任意一种灵芝菌种。灵芝斜面菌种采用PDA培养基制备。1000mLPDA培养基含 200g马铃薯提取液(去皮马铃薯切成碎片、1000mL蒸馏水煮沸30分钟,八层纱布过滤,滤液定容至1000mL,滤液即为马铃薯提取液)加入蔗糖20g、琼脂20g,煮沸待琼脂完全溶化后分装试管,塞上棉塞,121℃灭菌,制成斜面。无菌接种灵芝菌种,28℃培养7天,4℃冷藏待用。
[0017] 实施例1
[0018] 精确称取已经脱壳的白果200g,打浆加入200mL的水,煮沸糊化,温度降至60℃,加入0.4mL液化酶(无锡赛德生物工程有限公司,16万单位/mL)60℃水解50分钟,降温到50℃,加入0.2mL糖化酶(无锡赛德生物工程有限公司,2万单位/mL)50℃水解50分钟,降温到30℃,加入0.4g木瓜蛋白酶(广西南宁东恒华道生物科技有限公司,80万单位/g),水解9小时,制得银杏白果水解液;银杏白果水解液分装到250mL三角瓶,每瓶100mL,100℃灭菌60分钟,冷却后接入灵芝试管斜面菌种,在转速60转/分钟,温度22℃培养10天,制得灵芝液体摇瓶菌种;白果水解液经过100℃灭菌60分钟,以10%接种量接入灵芝的液体摇瓶菌种,在温度22℃,搅拌转速60转/分,通风量1:0.3v/v/m培养8天,制得灵芝银杏一级液体菌种;银杏白果水解液经过100℃灭菌60分钟,以3%接种量接入灵芝的一级液体菌种,在温度22℃,搅拌转速60转/分,通风量1:0.3v/v/m培养10天,制得灵芝银杏发酵液;灵芝银杏发酵液加入加入200g大米和200mL水煮成的米饭,以及大米重的1%(1g)白酒酒曲(购自洋河酒厂)和大米重的0.5%(1g)酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae,安琪酵母股份有限公司),10℃发酵30天后,离心,上清液加入食用酒精25mL,柠檬酸0.1g,蜂蜜10g,调匀后获得灵芝银杏白果黄酒。该酒为米黄色。
[0019] 实施例2
[0020] 精确称取已经脱壳的白果200g,打浆加入1000mL水,煮沸糊化,降温至70℃加入加入1.6mL液化酶(无锡赛德生物工程有限公司,16万单位/mL)70℃水解30分钟,降温到60℃,加入1.6mL糖化酶(无锡赛德生物工程有限公司,2万单位/mL)60℃水解30分钟,降温到40℃,加入0.4g木瓜蛋白酶(广西南宁东恒华道生物科技有限公司,80万单位/g),水解6小时,制得银杏白果水解液;银杏白果水解液分装到250mL三角瓶,每瓶100mL,110℃灭菌30分钟,冷却后接入灵芝试管斜面菌种,在转速120转/分钟,温度28℃培养7天,制得灵芝液体摇瓶菌种;白果水解液经过110℃灭菌30分钟,以7%接种量接入灵芝的液体摇瓶菌种,在温度28℃,搅拌转速160转/分,通风量1:0.8v/v/m培养5天,制得灵芝银杏一级液体菌种;银杏白果水解液经过110℃灭菌30分钟,以7%接种量接入灵芝的一级液体菌种,在温度28℃,搅拌转速160转/分,通风量1:0.8v/v/m培养5天,制得灵芝银杏发酵液;
灵芝银杏发酵液加入加入500g大米和500mL水煮成的米饭,以及大米重的7.5g(2.5%)黄酒酒曲(购自中南食品科学研究院)和2g(0.4%)酵母,25℃发酵20天后,离心取清液加入食用酒精70mL.柠檬酸0.3g,蜂蜜20g,即为灵芝银杏白果黄酒。该酒为浅褐色。
[0021] 实施例3
[0022] 精确称取已经脱壳的白果200g,打浆,加入2000mL水,煮沸糊化,降温至80℃,加入100mL液化酶(无锡赛德生物工程有限公司,16万单位/mL)80℃水解10分钟,降温到70℃,加入100mL糖化酶(无锡赛德生物工程有限公司,2万单位/mL)70℃水解10分钟,降温到50℃,加入30g木瓜蛋白酶(广西南宁东恒华道生物科技有限公司,80万单位/g),水解0.5小时,制得银杏白果水解液;其中所述的摇瓶培养工艺是:银杏白果水解液分装到
250mL三角瓶,每瓶100mL,120℃灭菌10分钟,冷却后接入灵芝试管斜面菌种,在转速180转/分钟,温度33℃培养5天,制得灵芝液体摇瓶菌种;白果水解液经过120℃灭菌,以10%接种量接入灵芝的液体摇瓶菌种,在温度33℃,搅拌转速250转/分,通风量1:1.2v/v/m培养3天,制得灵芝银杏一级液体菌种;银杏白果水解液经过120℃灭菌10分钟,以10%接种量接入灵芝的一级液体菌种,在温度33℃,搅拌转速250转/分,通风量1: 1.2v/v/m培养
3天,制得灵芝银杏发酵液;灵芝银杏发酵液加入1000g大米和1000mL水煮成的米饭,以及大米重的5%(50g)黄酒酒曲(购自浙江力克生物科技有限公司 )和2%(20g)酵母,40℃发酵10天后,离心取清液加入食用酒精100mL,柠檬酸0.05g,蜂蜜20g勾兑即为灵芝银杏白果黄酒。该酒为褐色。
[0023] 实施例4
[0024] 实施例1、实施例2和实施例3的测定结果显示在表1
[0025] 表1:实施例1~3成分分析表
[0026]项目 实施例1 实施例2 实施例3
酒精度(%) 8.4 10.9 15.9
黄酮(mg/L) 2.0 3.8 4.7
银杏内酯(mg/L) 1.4 3.5 5.86
总萜类(mg/L) 31 431 733
蛋白质(mg/L) 74.5 70.4 168.9
灵芝酸(mg/L) 13.8 15.1 10.7
可溶性糖(%) 1.86 1.88 1.94
银杏酚酸(ppm) 4.12 3.67 2.91
氢氰酸(μg/L) 0.06 0.08 0.06
[0027] 实施例5
[0028] 60只ICR小鼠随机分为5 组,每组12 只。正常对照组25 ℃ 饲养;冷激对照组,冷激果酒组每天组每天上午8:00—12:00 置于(4±2)℃ 光照培养箱中,随后取出放回25 ℃ 环境中,冷刺激果酒组分别于每日16:00 灌胃施例1、实施例2和实施例3果酒,剂量为10mL/Kg体重,正常对照组、冷激对照组每天灌胃等量生理盐水作对照;所有组别正常投喂饲料,饮自来水。18 d 后按5 mL/Kg体重腹腔注射质量分数20% 氨基甲酸乙酯将小鼠麻醉,颈动脉插管法测量并记录血压。结果(表2)所有供试药物血压和模型对照组相比,均显著降低。
[0029] 表2:对照组与实验组小鼠血压值比较(1mmHg=0.133KPa,平均值±标准误)[0030]
[0031] 实施例6
[0032] 灵芝银杏果酒抗氧化能力评价采用采用普鲁士兰法测定抗氧化能力(赵艳红,李建科,李国秀.天然抗氧化物体外活性评价方法的优选与优化.食品科学,2008,29(6):64-69)。取1 mL灵芝银杏果酒,加入2.5 mL pH 6.6 的磷酸缓冲液和质量分数1%铁氰化钾溶液2.5 mL,混合后在50℃下放置20 min,加入质量分数10%三氯乙酸溶液2.5 mL混合,取混合液2.5 mL,加入2.5 mL蒸馏水和质量分数0.1% 氯化铁2.5 mL,混匀,静置10 min,在700 nm 处测定吸光度。以蒸馏水代替酒样重复上述操作作为对照。
吸光度越高,抗氧化性越好,还原力越强。每个实施例测定重复三次,结果以平均值表示(表
3)。结果显示实施例1~3的吸光度均显著高于对照组,说明实施例制得银杏果酒具有显著的降低氧化压力的作用。
[0033] 表3:实施例1~3银杏果酒酒样抗氧化作用评价
[0034]试验 对照 实施例1 实施例2 实施例3
吸光度 0.60 0.79 0.83 0.89