[0014] 下面结合具体实施例对本发明进行详细说明，但不应理解为本发明的限制。下列实施例中未注明具体条件的试验方法，通常按照常规条件操作，所用试剂均为市售，由于不涉及发明点，故不对其步骤进行详细描述。
[0015] 除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。
[0016] 本发明提供的一种山羊细胞克隆胚胎培养液，包括A液和B液，每升所述A液中含有0.2mg的硝酸亚铁、350mg的氯化钾、100‑120mg的柠檬酸、100mg的磷酸二氢钠、余量为DMEM高糖型液体培养基；
[0017] 每升所述B液中含有10‑20mg的胎牛血清、120‑150mg的苹果酸、0.2g的氯化钠、余量为M16液体培养基。
[0018] 其中，DMEM高糖型液体培养基、M16液体培养基分别是市售的DMEM高糖型培养基、M16培养基按照说明书配制成液体后制成。
[0019] 其中，所述苹果酸是L‑苹果酸、D‑苹果酸或者混合物DL‑苹果酸。
[0020] 实施例1
[0021] 一种山羊细胞克隆胚胎培养液，包括A液和B液，每升所述A液中含有0.2mg的硝酸亚铁、350mg的氯化钾、100mg的柠檬酸、100mg的磷酸二氢钠、余量为DMEM高糖型液体培养基；
[0022] 每升所述B液中含有15mg的胎牛血清、150mg的苹果酸、0.2g的氯化钠、余量为M16液体培养基。
[0023] 所述苹果酸是L‑苹果酸。
[0024] 实施例2
[0025] 一种山羊细胞克隆胚胎培养液，包括A液和B液，每升所述A液中含有0.2mg的硝酸亚铁、350mg的氯化钾、120mg的柠檬酸、100mg的磷酸二氢钠、余量为DMEM高糖型液体培养基；
[0026] 每升所述B液中含有17mg的胎牛血清、120mg的苹果酸、0.2g的氯化钠、余量为M16液体培养基。
[0027] 所述苹果酸是D‑苹果酸。
[0028] 实施例3
[0029] 一种山羊细胞克隆胚胎培养液，包括A液和B液，每升所述A液中含有0.2mg的硝酸亚铁、350mg的氯化钾、100mg的柠檬酸、110mg的磷酸二氢钠、余量为DMEM高糖型液体培养基；
[0030] 每升所述B液中含有10mg的胎牛血清、130mg的苹果酸、0.2g的氯化钠、余量为M16液体培养基。
[0031] 所述苹果酸是混合物DL‑苹果酸。
[0032] 实施例4
[0033] 一种山羊细胞克隆胚胎培养液，包括A液和B液，每升所述A液中含有0.2mg的硝酸亚铁、350mg的氯化钾、100mg的柠檬酸、115mg的磷酸二氢钠、余量为DMEM高糖型液体培养基；
[0034] 每升所述B液中含有20mg的胎牛血清、140mg的苹果酸、0.2g的氯化钠、余量为M16液体培养基。
[0035] 所述苹果酸是L‑苹果酸、D‑苹果酸或者混合物DL‑苹果酸。
[0036] 实施例1‑4的培养液配制时，先配制好DMEM高糖型液体培养基，然后按照配方称取各组分，混匀，充分溶解即可。
[0037] 本发明还提供了一种山羊细胞克隆胚胎的培养方法，首先按常规方式制备重组好的山羊受精卵，然后利用下述实施例5的方法使受精卵发育，培养至细胞克隆胚胎的囊胚。下面以实施例1中的培养液配方为例，说明实施例5的方法步骤。
[0038] 实施例5
[0039] 一种山羊细胞克隆胚胎的培养方法，包括以下步骤：
[0040] 步骤1，将重组好的山羊受精卵置于实施例1所述的A液中离体培养，直至胚胎发育到二细胞期；
[0041] 步骤2，将发育到二细胞期的胚胎用0.85g/100ml氯化钠溶液清洗后，接着置于实施例1所述的B液中离体培养，直至克隆胚胎发育至囊胚。
[0042] 发育至囊胚后便可按照常规方法植物母体子宫，进行分化发育。
[0043] 一、不同培养液的比较
[0044] 我们将重组的山羊受精卵置于不同培养液中培养，培养方法均同实施例5，只是不同阶段采用的培养液不同，设计以下几组试验：
[0045] A组：采用实施例1的培养液和实施例5的培养方法进行胚胎发育培养。
[0046] B组：将重组好的山羊受精卵置于实施例1所述的A液中离体培养，直至克隆胚胎发育至囊胚。
[0047] C组：将重组好的山羊受精卵置于实施例1所述的B液中离体培养，直至克隆胚胎发育至囊胚。
[0048] D组：将重组好的山羊受精卵置于DMEM高糖型液体培养基中离体培养，直至克隆胚胎发育至囊胚。
[0049] E组：将重组好的山羊受精卵置于M16液体培养基中离体培养，直至克隆胚胎发育至囊胚。
[0050] F组：与A组的操作基本相同，区别仅在于将实施例1的A液中柠檬酸去除，将B液中的苹果酸去除。
[0051] G组：与A组的操作基本相同，区别仅在于将实施例1的A液中柠檬酸去除。
[0052] H组：与A组的操作基本相同，区别仅在于将实施例1的B液中的苹果酸去除。
[0053] 观察记录上述分组中山羊受精卵的体外发育率。结果如表1所示。由表1的结果可知，与D组、E组两个现有培养基相比，A组获得的二细胞胚胎数、四细胞胚胎数、桑葚胚数、囊胚数、囊胚植入母体后成活数均较高，山羊受精卵的体外发育率和囊胚植入母体后成活率总体较高；
[0054] 比较A、B、C、D、E组，发现单独使用A液的B组或者单独使用B液的C组，最后获得的囊胚数，囊胚植入母体后成活数低于A组，高于D、E组；
[0055] 比较A、F、G、H组，发现添加柠檬酸和苹果酸，最后获得的囊胚数、囊胚植入母体后成活数高于不添加柠檬酸、不添加苹果酸或者柠檬酸、苹果酸均不添加的F、G、H组，说明柠檬酸和苹果酸有助于提高山羊受精卵体外发育率和囊胚植入母体后成活率。
[0056] 表1 100个克隆胚胎在不同培养方法中的发育数
[0057]
[0058] 尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。
[0059] 显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。
