一种基于核酸适配体和量子点同时检测链霉素氯霉素四环素三种抗生素残留的方法   0    0

一种基于核酸适配体和量子点同时检测链霉素氯霉素四环素三种抗生素残留的方法，属于分析化学技术领域。本发明设计合成了三段互补cDNA1序列，分别与三种抗生素适配体DNA序列互补，同时还与三种抗生素各自的捕获探针DNA序列和互补cDNA2序列部分互补。三种cDNA1首先和各自互补的适配体DNA杂交形成双链DNA，当样品中存在目标抗生素时，适配体DNA优先与其对应的抗生素结合使双链DNA去杂交并释放出cDNA1。游离cDNA1与修饰在金电极表面的捕获探针DNA结合，三种量子点修饰的cDNA2与cDNA1的另一端杂交。金电极表面的三种量子点经酸溶后会产生与目标抗生素对应的溶出伏安峰。利用峰电流值的变化和抗生素浓度之间的关系实现对三种抗生素的检测。该方法具有良好的重复性、稳定性和高灵敏度，可用于对牛奶等样品中的三种抗生素残留进行直接测定。

1.一种基于核酸适配体和量子点同时检测链霉素STR，氯霉素CHL，四环素TET三种抗生素残留的方法，其特征在于包括以下步骤：PbS、CdS及ZnS三种量子点的制备；将链霉亲和素标记到合成的三种量子点上；将链霉亲和素标记的三种量子点修饰到对应的三种带有生物素的cDNA2序列上；在金电极表面修饰三种捕获探针DNA序列；三种cDNA1序列与对应的适配体DNA序列互补杂交形成三种双链DNA；含有三种目标抗生素的样品与三种双链DNA混合，适配体DNA会优先与其对应的抗生素结合从而使得双链DNA去杂交并释放出cDNA1；游离cDNA1序列与对应的捕获探针DNA序列结合；加入修饰有量子点的cDNA2序列使之与cDNA1序列另一端结合；酸溶量子点；检测三种抗生素对应的溶出伏安峰电流；具体步骤为：
（1）PbS、CdS及ZnS三种量子点的制备
将9.22 μL的巯基乙酸加入到50 mL 0.4 mM的Pb(NO3)2溶液中，用0.5 M 的NaOH调pH至
7，随后通氮气30min，将37.3 mL 1.34 mM的Na2S溶液逐滴加入上述混合溶液中，通氮气搅拌24h后即得直径在10 nm的棕色PbS量子点，于4℃黑暗保存；
将7.68 μL的巯基乙酸加入到100 mL 1 mM的CdCl2溶液中，用0.5 M的 NaOH调pH至11，随后通氮气30 min，将50 mL 1.34 mM的Na2S溶液逐滴加入上述混合溶液中，通氮气搅拌
24h后即得直径在10 nm的黄绿色CdS量子点，于4℃黑暗保存；
将38.4 μL的巯基乙酸加入到50 mL 5 mM 的ZnCl2溶液中，用0.5 M 的NaOH调pH至8，随后通氮气30 min，将50 mL 5 mM的Na2S溶液逐滴加入上述混合溶液中，通氮气搅拌24小时后即得直径在10 nm的微白色ZnS量子点，于4℃黑暗保存；
（2）将链霉亲和素标记到合成的三种量子点上
将步骤（1）中配制好的三种量子点溶液各取2 mL后分别用4 mL 10 mM、pH 7.4的PBS缓冲溶液悬浮，形成3份6 mL的混合溶液，向每份混合溶液中加入20 μL新鲜配制的10 mg/mL EDC溶液活化10 min，随后迅速加入30 μL新鲜配制的10 mg/mL sulfo-NHS溶液，10 min后加入100 μL 1 mg/mL链霉亲和素溶液并将pH调至7，将上述溶液黑暗震荡2 h后用0.22 μm的滤膜过滤，随后在4℃下10000 r/min离心20 min，去上清，水洗三次，最后重悬于2 mL 10 mM、pH 7.4的PBS溶液中于4℃黑暗保存，得链霉亲和素标记的三种量子点；
（3）将链霉亲和素标记的三种量子点修饰到对应的三种带有生物素的cDNA2序列上将三种带有生物素的cDNA2序列分别与200 μL链霉亲和素标记的对应的三种量子点于
37℃孵育1.5 h，随后在4℃下10000 r/min离心20 min去上清，水洗三次，最后重悬于200 μL 10 mM、pH 7.4的PBS溶液中于4℃黑暗保存；
链霉素cDNA2浓度为1.5 μM，序列为：
5’-TTCTGTCTCTCG-Biotin-3’；
氯霉素cDNA2浓度为1.4 μM，序列为：
5’-ACGGTCGGTTACA-Biotin-3’；
四环素cDNA2浓度为1.8 μM，序列为：
5’-GCTACACGCCTTT-Biotin-3’；
所有DNA序列皆用超纯水作为溶剂；
（4）在金电极表面修饰三种捕获探针DNA序列
用0.5 µm及0.05 µm的氧化铝粉末在抛光布上先后打磨金电极表面；然后对金电极进行超声清洗，依次用超纯水、无水乙醇、超纯水分别超声处理5 min，用超纯水清洗后，氮气吹干金电极表面；将电极置于0.5 mol/L的H2SO4溶液中在-0.2V～1.6 V电位范围内以100 mV/s的扫描速度循环扫描，于0.8V的出峰不再增加即为清洗完成；用超纯水冲洗金电极表面3次，氮气吹干，使金电极表面光滑干净；将金电极倒立放置，将三种捕获探针DNA溶液同时覆盖在金电极表面，用小离心管盖在金电极表面防止溶液过快蒸发，室温下放置过夜，使捕获探针DNA一端的巯基与金电极表面之间进行共价结合；
链霉素捕获探针DNA浓度为1 μM，序列为：
5’-HS-(CH2)6-CGTGTTGGTGTT-3’；
氯霉素捕获探针DNA浓度为1.2 μM，序列为：
5’-HS-(CH2)6-GAGGATTCAGTGA-3’；
四环素捕获探针DNA浓度为1.5 μM，序列为：
5’-HS-(CH2)6-ATGTAGCTAGGTG-3’；
（5）三种cDNA1序列与对应的适配体DNA序列互补杂交形成三种双链DNA；
将cDNA1序列与对应的适配体DNA序列两段序列于95℃加热3 min，于37℃孵育1.5 h；
链霉素适配体DNA序列和cDNA1浓度一致为0.8 μM，序列分别为：
Ap-DNA：5’-TAGGGAATTC GTCGACGGAT CCGGGGTCTG GTGTTCTGCT TTGTTCTGTC GGGTCGTCTG CAGGTCGACG CATGCGCCG-3’；
cDNA1：5’-GACAGAACAA AGCAGAACAC CA-3’；
氯霉素适配体DNA序列和cDNA1浓度一致为1 μM，序列分别为：
Ap-DNA：5’-AGCAGCACAG AGGTCAGATG ACTTCAGTGA GTTGTCCCAC GGTCGGCGAG TCGGTGGTAG CCTATGCGTG CTACCGTGAA-3’；
cDNA1：5’-CCGACCGTGG GACAACTCAC TGAA-3’；
四环素适配体DNA序列和cDNA1浓度一致为1 μM，序列分别为：
Ap-DNA：5’-CGTACGGAAT TCGCTAGCGG GCGGACGCTA GGTGGTGATG CTGTGCTACA CGTGTTGTGG ATCCGAGCTC CACGTG-3’；
cDNA1：5’-CGTGTAGCAC AGCATCACCA CCTACC-3’；
（6）加入含有三种目标抗生素链霉素、氯霉素及四环素的样品
向步骤（5）中含对应的cDNA1序列与对应的适配体DNA序列的混合溶液中同时加入含有链霉素、氯霉素及四环素的样品各20 μL，于室温孵育1 h；
（7）游离cDNA1序列与对应的捕获探针DNA序列结合
由于适配体会优先与其对应的抗生素结合从而会使得双链DNA解旋并释放出cDNA1序列，将释放出游离cDNA1序列的溶液覆盖于修饰有捕获探针DNA序列的金电极之上，于37℃孵育1.5 h；
（8）加入修饰有量子点的cDNA2序列使之与cDNA1序列另一端结合
将步骤（3）制备的修饰有量子点的cDNA2序列的溶液覆盖于修饰cDNA1序列的金电极之上，于37℃孵育1.5 h；
（9）酸溶量子点
用1 M的硝酸溶解间接固定在金电极上的量子点45 min；
（10）检测三种抗生素对应的溶出伏安峰电流
将酸溶后的量子点溶液加入含500 µg/L铋离子的醋酸-醋酸钠缓冲溶液中，随后通过玻碳电极用方波溶出伏安法进行检测，间接固定至金电极表面的三种量子点经酸溶后会产生与目标抗生素对应的溶出伏安峰；检测条件如下：首先在0.6V预处理60s，随后在搅拌条件下于-1.4V沉积120s，最后用方波伏安法在-1.4V～-0.5V扫描，其中跨步电压为5mV，频率为20Hz，振幅为25mV。