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一株海洋冷杆菌及用其制备絮凝剂的方法 0 0

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申请进展

基本信息

申请人信息

代理人信息

摘要

法律状态

权利要求

说明书

专利申请流程有哪些步骤？

申请

申请号：指国家知识产权局受理一件专利申请时给予该专利申请的一个标示号码。唯一性原则。

申请日：提出专利申请之日。

2017-09-18

申请公布

申请公布指发明专利申请经初步审查合格后，自申请日（或优先权日）起18个月期满时的公布或根据申请人的请求提前进行的公布。

申请公布号：专利申请过程中，在尚未取得专利授权之前，国家专利局《专利公报》公开专利时的编号。

申请公布日：申请公开的日期，即在专利公报上予以公开的日期。

2018-02-16

授权

授权指对发明专利申请经实质审查没有发现驳回理由，授予发明专利权；或对实用新型或外观设计专利申请经初步审查没有发现驳回理由，授予实用新型专利权或外观设计专利权。

2020-07-10

预估到期

发明专利权的期限为二十年，实用新型专利权期限为十年，外观设计专利权期限为十五年，均自申请日起计算。专利届满后法律终止保护。

2037-09-18

基本信息

有效性	有效专利	专利类型	发明专利
申请号	CN201710843126.9	申请日	2017-09-18
公开/公告号	CN107619802B	公开/公告日	2020-07-10
授权日	2020-07-10	预估到期日	2037-09-18
申请年	2017年	公开/公告年	2020年
缴费截止日
分类号	C12N1/20 、C12P19/04 、C02F1/56 、C12R1/01	主分类号	C12N1/20
是否联合申请	独立申请	文献类型号	B
独权数量	1	从权数量	5
权利要求数量	6	非专利引证数量	1
引用专利数量	5	被引证专利数量	0
非专利引证	1、杜宁.南极微生物絮凝剂产生菌的筛选、分子鉴定及适应性研究《.化学与生物工程》.2012,第29卷(第9期),第40-42页.;
引用专利	CN104560831A、CN101580550A、CN106282069A、CN106830357A、CN107089712A	被引证专利
专利权维持	4	专利申请国编码	CN
专利事件		事务标签	公开、实质审查、授权

申请人信息

申请人	浙江海洋大学	第一申请人	浙江海洋大学
专利权人	浙江海洋大学	当前专利权人	浙江海洋大学
发明人	穆军、崔霞、杨桥	第一发明人	穆军
地址	浙江省舟山市定海区临城街道海大南路1号	邮编	316022
申请人数量	1	发明人数量	3
申请人所在省	浙江省	申请人所在市	浙江省舟山市

代理人信息

代理机构

专利代理机构是经省专利管理局审核，国家知识产权局批准设立，可以接受委托人的委托，在委托权限范围内以委托人的名义办理专利申请或其他专利事务的服务机构。

杭州杭诚专利事务所有限公司

代理人

专利代理师是代理他人进行专利申请和办理其他专利事务，取得一定资格的人。

尉伟敏

摘要

本发明涉及水处理技术领域，具体涉及一株海洋冷杆菌及用其制备絮凝剂的方法，该海洋冷杆菌菌株Psychrobacter sp.GHF2从菲律宾蛤仔吐出的污泥液中分离纯化得到，将该菌株的菌种扩大培养后制成菌种液，将菌种液经发酵培养后制成发酵菌液，在发酵后期向发酵菌液中加入絮凝载体，并与加入的乙醇相互强化作用使发酵菌液中的胞外多糖沉降较为完全。本发明筛选的海洋冷杆菌菌株Psychrobacter sp.GHF2分泌的胞外多糖具有较强的絮凝效果，在发酵后期添加絮凝载体，使菌体在絮凝载体上凝聚成团，促进胞外多糖的沉降，而且减少乙醇的使用，所得絮凝剂的絮凝能力强，性能稳定。

摘要附图
说明书附图：[0010]

法律状态

序号	法律状态公告日	法律状态	法律状态信息
1	2020-07-10	授权
2	2018-02-16	实质审查的生效	IPC(主分类): C12N 1/20 专利申请号: 201710843126.9 申请日: 2017.09.18
3	2018-01-23	公开

权利要求

权利要求书是申请文件最核心的部分，是申请人向国家申请保护他的发明创造及划定保护范围的文件。

1.一种用海洋冷杆菌菌株GHF2制备絮凝剂的方法，其中所述海洋冷杆菌菌株GHF2保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：中国，北京，中国科学院微生物研究所，保藏日期：2017年8月9日，保藏编号CGMCC No.：14509；包括以下步骤：
(1)将菌种接种到固体培养基上培养，然后加入无菌水制成菌种液；
(2)将菌种液接种到液体培养基中发酵培养制成发酵菌液；
(3)向发酵菌液中加入絮凝载体并继续发酵培养得到原料液；
(4)向原料液中加入乙醇静置沉降，然后离心分离沉降物，经干燥后制成絮凝剂；
其中1kg的液体培养基的组份如下：蛤肉汤30～50g、蛋白胨2～3g、磷酸氢二钾0.6～
1.8g、硫代硫酸钠0.3～0.7g、柠檬酸铁铵0.5～1.1g和葡萄糖20～30g，余量为陈化海水；
步骤(2)中菌种液的接种浓度为0.8～1.4mL菌种液/100mL液体培养基，发酵培养的温度为18～23℃，培养时间3～5天；
步骤(3)中絮凝载体的加入量为5～10g/100mL发酵菌液，继续发酵培养1～3天。

2.根据权利要求1所述的用海洋冷杆菌菌株GHF2制备絮凝剂的方法，其特征在于，固体培养基为向1kg的液体培养基中加入15～20g的琼脂凝固制成的斜面培养基。

3.根据权利要求1所述的用海洋冷杆菌菌株GHF2制备絮凝剂的方法，其特征在于，步骤(1)中培养温度为18～23℃、时间36～48小时，无菌水与固体培养基的体积比为1.0～1.5:
1。

4.根据权利要求1所述的用海洋冷杆菌菌株GHF2制备絮凝剂的方法，其特征在于，步骤(2)中摇床转速为160～200r/min。

5.根据权利要求1所述的用海洋冷杆菌菌株GHF2制备絮凝剂的方法，其特征在于，所述絮凝载体为沙土、泥沙、海沙、硅藻土、活性炭、贝壳粉、生物炭、壳聚糖和膨润土中的一种或几种，所述絮凝载体经200～300目筛网过筛后灭菌使用。

6.根据权利要求1所述的用海洋冷杆菌菌株GHF2制备絮凝剂的方法，其特征在于，步骤(4)中乙醇与原料液的体积比为2～4:1，在1～5℃静置6～10小时，离心速率3000～5000r/min，干燥温度为90～105℃，干燥时间1～2小时。

说明书

技术领域

[0001] 本发明涉及水处理技术领域，具体涉及一株海洋冷杆菌及用其制备絮凝剂的方法。

背景技术

[0002] 我国近十年的城市化发展迅速，但由于污水处理设施投入滞后、污水处理效率低，大量的工业废水、生活污水排放造成严重的水环境恶化，使水体中重金属、色素及悬浮颗粒含量超标，水资源现已成为制约社会城市化和工业化发展的重要因素。提升污水处理技术、强化城市污水治理能力已经成为当务之急。其中在污水中引入适当粒径的絮状颗粒物，利用其巨大的表面积对重金属、色素和悬浮颗粒进行絮凝吸附形成絮状体，通过沉降或离心方式从水体中分离出已经成为治理污水的重要方法。

[0003] 絮凝法的关键在于选择合适的絮凝剂，常用的絮凝剂有无机絮凝剂、有机絮凝剂、生物絮凝剂等，其中生物絮凝剂因处理效果好，且与环境的相容性高而受到重视。生物絮凝剂主要有微生物絮凝体及微生物产生的胞外聚合物，微生物絮凝体在水体中的生存条件要求较为苛刻，而微生物产生的胞外聚合物使用较为方便。胞外聚合物主要是部分胞外多糖，可以使重金属离子、色素及悬浮颗粒等凝集沉降，安全高效。目前从环境中分离出的可以分泌具有絮凝效果的胞外多糖的微生物主要有酱油曲霉、红平红球菌与类芽孢杆菌等，但是利用这些微生物制备胞外多糖絮凝剂还主要处于研究阶段，存在产量低、絮凝活性低等问题。

发明内容

[0004] 针对现阶段微生物制备胞外多糖絮凝剂存在絮凝活性低的问题，本发明的目的在于提供一株可以分泌具有絮凝作用的胞外多糖的海洋冷杆菌，该海洋冷杆菌菌株从菲律宾蛤仔吐出的污泥液中分离纯化而得，由该海洋冷杆菌菌株分泌的胞外多糖制备的絮凝剂的絮凝活性高，絮凝能力强，性能稳定。

[0005] 同时本发明的另一目的在于提供用该海洋冷杆菌菌株制备絮凝剂的方法，[0006] 本发明提供如下的技术方案：

[0007] 一株海洋冷杆菌Psychrobacter sp.GHF2，所述海洋冷杆菌菌株GHF2保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：中国，北京，中国科学院微生物研究所，保藏日期：2017年8月9日，保藏编号CGMCC No.：14509，建议的分类命名为海水嗜冷杆菌，拉丁文学名为Psychrobacter aquimaris。本发明的海洋冷菌菌菌株GHF2从菲律宾蛤仔吐出的污泥液中分离得到，经实验发现，该海洋冷杆菌菌株GHF2的分泌物，主要是胞外多糖有絮凝作用。

[0008] 上述海洋冷杆菌菌株Psychrobacter sp.GHF2的16S rDNA全序列(1280bp)已向美国国家生物技术信息中心(NCBI)的GenBank基因序列数据库提交，登陆号为KX702255，全序列如下：

[0009]

[0010] 一种用海洋冷杆菌菌株GHF2制备絮凝剂的方法，包括以下步骤：

[0011] (1)将菌种接种到固体培养基上培养，然后加入无菌水制成菌种液；

[0012] (2)将菌种液接种到液体培养基中发酵培养制成发酵菌液；

[0013] (3)向发酵菌液中加入絮凝载体并继续发酵培养得到原料液；

[0014] (4)向原料液中加入乙醇静置沉降，然后离心分离沉降物，经干燥后制成絮凝剂。

[0015] 首先将海洋冷杆菌菌株GHF2的菌种扩大培养后制成菌种液，将菌种液经发酵培养后制成发酵菌液，发酵菌液中含有丰富的胞外多糖，在发酵后期向发酵菌液中加入絮凝载体，絮凝载体可以提供菌体的粘附场所，使菌体粘结成团，加快胞外多糖的沉降，在乙醇的作用下发酵菌液中游离的胞外多糖也迅速沉降，粘附在絮凝载体的菌体结团上，沉降较为完全。

[0016] 作为本发明方法的一种改进，1kg的液体培养基的组份如下：蛤肉汤30～50g、蛋白胨2～3g、磷酸氢二钾0.6～1.8g、硫代硫酸钠0.3～0.7g、柠檬酸铁铵0.5～1.1g和葡萄糖 20～30g，余量为陈化海水；

[0017] 固体培养基为向1kg的液体培养基中加入15～20g的琼脂凝固制成的斜面培养基。可以满足海洋冷杆菌菌株GHF2的菌种扩大培养及发酵培养的要求，提高胞外多糖的产率。

[0018] 作为本发明方法的一种改进，步骤(1)中培养温度为18～23℃、时间36～48小时，无菌水与固体培养基的体积比为1.0～1.5:1。合适的培养温度促进菌种的扩大培养的效果，无菌水混合后得到合适的菌种液浓度。

[0019] 作为本发明方法的一种改进，步骤(2)中菌种液的接种浓度为0.8～1.4mL菌种液/100 mL液体培养基，发酵培养的温度为18～23℃，培养时间3～5天，摇床转速为160～200r/min。菌种在液体培养基中充分发酵培养分泌胞外多糖，胞外多糖的产率高。

[0020] 作为本发明方法的一种改进，步骤(3)中絮凝载体的加入量为5～10g/100mL发酵菌液，继续发酵培养1～3天。在发酵过程的后期中加入絮凝载体既避免对菌种前期发酵过程的影响，絮凝载体直接凝聚发酵菌液中的菌体及胞外多糖，促进胞外多糖的沉降，减少沉降剂乙醇的使用，而且便于离心分离。

[0021] 作为本发明方法的一种改进，所述絮凝载体为沙土、泥沙、海沙、硅藻土、活性炭、贝壳粉、生物炭、壳聚糖和膨润土中的一种或几种，所述絮凝载体经200～300目筛网过筛后灭菌使用。所选用的絮凝载体具有较大的比表面积或者丰富的孔隙结构，对菌体和胞外多糖的凝聚效果强，同时能提高絮凝剂的絮凝能力。

[0022] 作为本发明方法的一种改进，步骤(4)中乙醇与原料液的体积比为2～4:1，在1～5℃ 静置6～10小时，离心速率3000～5000r/min，干燥温度为90～105℃，干燥时间1～2小时。通过加入乙醇与絮凝载体共同作用使胞外多糖尽可能充分沉降，提高胞外多糖收率。

[0023] 本发明的有益效果如下：

[0024] 本发明筛选的海洋冷杆菌菌株Psychrobacter sp.GHF2分泌的胞外多糖具有较强的絮凝效果，在发酵后期添加絮凝载体，使菌体在絮凝载体上凝聚成团，促进胞外多糖的沉降，而且减少乙醇的使用，所得絮凝剂的絮凝能力强，性能稳定。

实施方案

[0025] 下面就本发明的具体实施方式作进一步说明。

[0026] 如无特别说明，本发明中所采用的原料均可从市场上购得或是本领域常用的，如无特别说明，下述实施例中的方法均为本领域的常规方法。

[0027] 陈化海水为取新鲜海水在23℃静置沉降7天后所得的海水的上清液。

[0028] 蛤肉汤为250g蛤仔洗净后置于2kg蒸馏水中在高压锅内蒸煮2小时后过滤的汁液。

[0029] 一株海洋冷杆菌Psychrobacter sp.GHF2，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：中国，北京，中国科学院微生物研究所，保藏日期：2017年8月9 日，保藏编号CGMCC No.：14509，建议的分类命名为海水嗜冷杆菌，拉丁文学名为 Psychrobacter aquimaris。该海洋冷杆菌菌株Psychrobacter sp.GHF2从菲律宾蛤仔吐出的污泥液中分离，该海洋冷杆菌菌株Psychrobacter sp.GHF2的分泌物，主要是胞外多糖有絮凝作用。

[0030] 实施例1

[0031] 一种用海洋冷杆菌菌株GHF2制备絮凝剂的方法，包括以下步骤：

[0032] (1)将菌种接种到固体培养基上18℃培养36小时，然后加入无菌水制成菌种液，无菌水与固体培养基的体积比为1.0:1；

[0033] (2)将菌种液接种到液体培养基中，接种浓度为0.8mL菌种液/100mL液体培养基，在18℃ 发酵培养3天，摇床转速为160r/min，制成发酵菌液；

[0034] (3)向发酵菌液中加入絮凝载体，加入量为5g/100mL发酵菌液，然后继续发酵培养1天得到原料液，絮凝载体为沙土，优选养殖菲律宾蛤仔的天然沙土，絮凝载体经200目筛网过筛后灭菌使用；

[0035] (4)向原料液中加入乙醇静置沉降，乙醇与原料液的体积比为2:1，在1℃静置沉降6小时，然后以3000r/min离心分离沉降物，然后在90℃干燥2小时制成絮凝剂。

[0036] 其中1kg的液体培养基的组份如下：蛤肉汤30g、蛋白胨2g、磷酸氢二钾0.6g、硫代硫酸钠0.3g、柠檬酸铁铵0.5g和葡萄糖20g，余量为陈化海水，固体培养基为向1kg的液体培养基中加入15g的琼脂凝固制成的斜面培养基。

[0037] 实施例2

[0038] 一种用海洋冷杆菌菌株GHF2制备絮凝剂的方法，包括以下步骤：

[0039] (1)将菌种接种到固体培养基上20℃培养42小时，然后加入无菌水制成菌种液，无菌水与固体培养基的体积比为1.25:1；

[0040] (2)将菌种液接种到液体培养基中，接种浓度为1.1mL菌种液/100mL液体培养基，在20℃ 发酵培养4天，摇床转速为180r/min，制成发酵菌液；

[0041] (3)向发酵菌液中加入絮凝载体，加入量为7.5g/100mL发酵菌液，然后继续发酵培养2天得到原料液，絮凝载体为沙土，优选养殖菲律宾蛤仔的天然沙土，絮凝载体经250目筛网过筛后灭菌使用；

[0042] (4)向原料液中加入乙醇静置沉降，乙醇与原料液的体积比为3:1，在4℃静置8小时，然后4000r/min离心分离沉降物，然后在100℃干燥1.5小时制成絮凝剂。

[0043] 其中1kg的液体培养基的组份如下：蛤肉汤40g、蛋白胨2.5g、磷酸氢二钾1.2g、硫代硫酸钠0.5g、柠檬酸铁铵0.8g和葡萄糖25g，余量为陈化海水，固体培养基为向1kg 的液体培养基中加入17g的琼脂凝固制成的斜面培养基。

[0044] 实施例3

[0045] (1)将菌种接种到固体培养基上23℃培养48小时，然后加入无菌水制成菌种液，无菌水与固体培养基的体积比为1.5:1；

[0046] (2)将菌种液接种到液体培养基中，接种浓度为1.4mL菌种液/100mL液体培养基，在23℃ 发酵培养5天，摇床转速为200r/min，制成发酵菌液；

[0047] (3)向发酵菌液中加入絮凝载体，加入量为10g/100mL发酵菌液，然后继续发酵培养3天得到原料液，絮凝载体为沙土，优选养殖菲律宾蛤仔的天然沙土，絮凝载体经300目筛网过筛后灭菌使用；

[0048] (4)向原料液中加入乙醇静置沉降，乙醇与原料液的体积比为4:1，在5℃静置10小时，然后5000r/min离心分离沉降物，然后在105℃干燥1小时制成絮凝剂。

[0049] 其中1kg的液体培养基的组份如下：蛤肉汤50g、蛋白胨3g、磷酸氢二钾1.8g、硫代硫酸钠0.7g、柠檬酸铁铵1.1g和葡萄糖30g，余量为陈化海水，固体培养基为向1kg的液体培养基中加入20g的琼脂凝固制成的斜面培养基。

[0050] 需要说明的是，将絮凝载体沙土替换为泥沙、海沙、硅藻土、膨润土、活性炭、生物炭、壳聚糖和贝壳粉中的一种，或者泥沙、海沙、硅藻土、膨润土、活性炭、生物炭、壳聚糖和贝壳粉中任意两种或多种的混合也可以起到相近沉降效果，而且絮凝剂的絮凝能力相近。

[0051] 絮凝剂性能测定

[0052] 分别用蒸馏水配制4g/L的高岭土悬浊液与10g/L的氯化钙溶液，取100mL高岭土悬浊液与 5mL氯化钙溶液混匀得到混合液，用3支10mL的比色管各盛取5mL的混合液，依次标记为管1、管2、管3，然后分别取实施例1、实施例2、实施例3中制备的絮凝剂0.3g各自对应加入管1、管2、管3中，300r/min下搅拌10分钟，再50r/min下搅拌2分钟，然后静置10 分钟，在波长550nm处测量吸光度，对照样为配制混合液所用蒸馏水，根据吸光度计算絮凝率。其中絮凝率为测试样的吸光度值排除对照样的吸光度值后相对测试样的吸光度值的百分比，结果如表1所示。

[0053] 表1絮凝率实施例实施例1 实施例2 实施例3
絮凝率/％ 85 89 88

[0054] 絮凝剂的应用

[0055] 取对数期生长的小球藻的藻液100mL，加入由海洋冷杆菌菌株Psychrobacter sp.GHF2制备的絮凝剂0.3g，在23℃下快速搅拌2～3分钟，搅拌速率150r/min，然后静置30分钟，小球藻的沉降率达到70％～77％，具体结果如表2所示。

[0056] 表2小球藻絮凝率实施例实施例1 实施例2 实施例3
絮凝率/％ 70.5％ 73％ 77.6％

1一种污水处理用的污水处理箱 2一种泔水处理场泔水处理装置 3一种污水处理用的污水处理箱 4水处理装置 5一种污水处理用污水处理剂喷洒机 6一种污水处理用污水处理剂喷洒机 7一种污水处理用的加药污水处理装置 8一种污水处理用的加药污水处理装置 9一种污水处理用的加药污水处理装置 10一种污水处理用的加药污水处理装置