[0020] 应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
[0021] 需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
[0022] 正如背景技术所介绍的，针对现有技术中存在的不足，为了解决如上的技术问题，本发明提出了2‑苯基吡唑[1,5‑a]嘧啶类化合物作为肿瘤耐药逆转剂的应用。
[0023] 本发明第一方面，提供一种化合物，其选自下述化合物或其药用盐、溶剂化物、水合物作为肿瘤耐药逆转剂的应用。
[0024]
[0025] 优选的，所述肿瘤耐药逆转剂为转运泵抑制剂。
[0026] 进一步优选的，所述转运泵抑制剂为耐药蛋白(ABCG2)转运抑制剂。
[0027] 进一步优选的，所述肿瘤耐药的药物为米托蒽醌或阿霉素。
[0028] 本发明第二方面，提供一种药物组合物，所述药物组合物包括第一方面所述化合物、所述化合物的药用盐、溶剂化物、水合物中的一种或几种，及药用载体。
[0029] 优选的，所述药物组合物中还包括用于治疗或辅助治疗肿瘤的药物。
[0030] 优选的，所述治疗或辅助治疗肿瘤的药物包括但不限于喜树碱类似物、酪氨酸激酶抑制剂、蒽环霉素类药物、抗HIV病毒药物，抗风湿药，免疫抑制剂及抗生素。
[0031] 更为优选的，所述治疗肿瘤的药物为ABCG2耐药相关药物。
[0032] 在一些实施方式中，所述药物组合物和至少一种抗肿瘤药物分别以独立的剂型组合成组合产品，如套装药品(kit of part)。
[0033] 优选的，所述药物组合物包括但不限于口服剂型、胃肠外给药剂型、外用剂型和直肠给药剂型。
[0034] 在一些实施方式中，所述药物组合物可以是口服的片剂、胶囊、丸剂、粉剂、缓释制剂、溶液和悬浮液，用于胃肠外注射的无菌溶液、悬浮液或乳液，用于外用的软膏或乳膏，或者用于直肠给药的栓剂。
[0035] 本发明第三方面，提供第一方面所述化合物或第二方面所述药物组合物在制备抗肿瘤药剂中的应用。
[0036] 本发明第四方面，提供一种肿瘤治疗方法，所述治疗方法包括采用第一方面所述化合物或第二方面所述药物组合物进行治疗。
[0037] 优选的，所述肿瘤为耐药型肿瘤疾病，进一步的，包括但不限于耐药型乳腺癌、耐药型非小细胞肺癌、耐药型弥漫性大B细胞淋巴瘤、耐药型急性髓细胞性白血病。
[0038] 为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本发明的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本发明的技术方案。
[0039] 实施例1计算机药物筛选
[0040] (1)ABCG2蛋白三维结构的获取、分析和处理；
[0041] 在蛋白数据库(https://www.rcsb.org/)中获得乳腺癌耐药蛋白ABCG2的三维结构(PDB code:5NJ3)。使用AUTODOCK tools软件包进行准备，首先对蛋白进行加氢，并删除蛋白中的水分子，然后在ff99sb力场条件下对蛋白进行能量优化和最小化。
[0042] (2)构建及处理对接用小分子配体库；
[0043] 建立对接小分子配体库；小分子结构在商业化化合物库ChemBridge,Chemdiv数据库中获取，使用Openbabel软件对配体进行2D转3D，结构优化以及格式转换等预处理。
[0044] (3)构建虚拟筛选系统；
[0045] 使用AUTODOCK tools软件生成格点盒子文件。
[0046] (4)用步骤(3)的计算机筛选系统对步骤(2)中的小分子配体库进行筛选；
[0047] 将准备的小分子配体与靶蛋白进行对接，首先使用AUTODOCK vina软件进行初筛，并选取打分前10％的化合物用S P(standard precision)模式进行复筛，然后根据打分选取前10％的化合物用XP(extra precision)模式进行精筛，保留最后打分前30％的化合物(230个)，然后对这些分子进行聚类，最后根据打分、配体的结合构象对化合物进行挑选，与实施例2同样方法筛选出具有ABCG2抑制活性的苗头化合物(1a)。
[0048] (5)相似性检索
[0049] 基于命中的先导化合物骨架进行相似性检索
[0050] (http://www.swisssimilarity.ch/)，搜索到160个化合物a1的类似物，使用AUTODOCK vina进行分子对接复筛，确定15个化合物,与实施例2同样方法测出这些化合物的IC50，发现有12个类似物的IC50小于300nM(表1所示)。
[0051] 实施例2生物活性测试
[0052] 细胞培养：H460/MX20(ABCG2高表达非小细胞肺癌耐药细胞株)培养在含10％胎牛血清和1％青‑链霉素的DMEM培养基中培养，细胞维持在37℃的含5％CO2的潮湿培养箱中。
[0053] 细胞毒性测试：使用MTT比色细胞增殖测定法确定体外细胞模型中的药物敏感性。准备单细胞悬液，并以每孔3000–8000的密度接种在96孔板上，分别加入一系列浓度的待测化合物。然后将细胞置于37℃，5％CO2的培养箱中48小时。将20μL 0.5％MTT加入每个孔中，再孵育4小时。然后除去上清液，并将150μLDMSO添加到每个孔中以溶解MTT晶体。用酶标仪在540nm处检测吸光度，测定基本无毒性剂量。
[0054] 耐药逆转活性测试：准备单细胞悬液，并以每孔3000–8000的密度接种在96孔板上，加入细胞毒性测定的最大无毒性剂量的待测化合物，ko143(2.5μmol/L)为阳性对照药，孵育1h后，加入一系列不同浓度的抗癌药物(米托蒽醌)，然后共孵育68小时。将20μL0.5％MTT加入每个孔中，再孵育4小时。然后除去上清液，并将150μL DMSO添加到每个孔中以溶解MTT晶体。用酶标仪在540nm处检测吸光度，并通过Bliss方法计算最大抑制浓度(IC50)的一半。按公式(1)计算2‑苯基吡唑[1,5‑a]嘧啶类化合物的耐药逆转倍数(RF)。活性结果如表1所示。
[0055]
[0056] 表1 2‑苯基吡唑[1,5‑a]嘧啶类化合物的耐药逆转活性
[0057]
[0058]
[0059] 以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
![2-苯基吡唑[1,5-a]嘧啶类化合物作为肿瘤耐药逆转剂的应用](/CN/2020/1/66/images/202010332642.jpg)
![2-苯基吡唑[1,5-a]嘧啶类化合物作为肿瘤耐药逆转剂的应用](/docs/cn/2021-06-25/CN111388477B/图1.jpg.150x150.jpg)