植物中丹皮酚检测用样品制备方法和丹皮酚检测方法   0    0

[0001] 本发明涉及生物技术领域，更具体的说是涉及一种植物中丹皮酚检测用样品制备方法、丹皮酚检测方法。

[0002] 常用中药牡丹皮为多年生落叶小灌木牡丹( Paeonia suffruticosa Andr.)的干燥根皮，味苦、辛，性微寒，具有清热凉血、活血散瘀的功能。牡丹中次生代谢物丹皮酚是牡丹皮的主要活性成分，也是《中国药典》（2010版）中规定的评价牡丹皮质量的定性与定量指标。丹皮酚(paeonol，简称Pae)，又称牡丹酚，是一种小分子的酚类化合物，白色或微黄色带有光泽的针状结晶，气特异，味微辣；易溶于乙醇，甲醇，在热水中溶解，在冷水中不溶；值得一提的是丹皮酚具有自发荧光的特点。

[0003] 组织化学是建立在形态学基础之上的的边缘学科，是研究细胞和组织中的化学组成、定位和定量以及代谢状态的科学，其根本的目的是联系形态、化学成分、功能来了解细胞或组织的代谢变化。组织化学的研究方法主要有化学方法、类化学方法、物理学方法、显微烧灰法等。随着科学技术的发展，一些先进的仪器设备，如激光共聚焦显微镜、原子力学显微镜等也渗透到组织化学的研究中。在经历了解释生物界中生理现象的生理组织学阶段后，组织化学进入到显微化学阶段，现今又步入到酶组织化学、电镜组织化学、定量组织化学和免疫组织化学等阶段。化学成分是药材防病与治病的物质基础，而这些成分是贮藏在特定的组织和细胞结构之中。中草药包括植物药、动物药和矿物药三类药材，其中植物药占到中草药资源的约百分之八十。因此，运用组织化学方法，明确药用植物的药用部位的组织结构，研究药用成分及其积累与药用植物的结构、发育等的关系，具有十分重要的理论与实践意义。

[0004] 目前丹皮酚提取与分析方法主要有水蒸气蒸馏法、有机溶剂浸出法、超临界流体萃取法（但在一般的实验性提取中较少应用）以及高效液相色谱法、薄层扫描法、化学发光法、气相色谱法等等；中国发明专利（申请号：200910175425）通过将展开的丹皮酚斑点与增荧光剂三氯化铝反应而用于丹皮酚的定量测定。但这些方法在确定丹皮酚在器官、组织和细胞中的细微含量、存在部位及分布状态方面却无能为力，而这恰恰是组织化学的优势。迄今为止，对牡丹中丹皮酚成分只是进行定量研究，没有在组织细胞水平上进行定位研究。丹皮酚具有自发荧光特性为利用组织化学方法进行研究提供了非常便利的条件和科学保障。

[0005] 针对现有技术的不足，本发明提供一种植物中丹皮酚检测用样品制备方法、丹皮酚检测方法。制备方法无需经过繁杂的化学成分提取、染色等过程，同时避免了丹皮酚的流失与弥散，而且保持了组织细胞结构和成分的原貌，在原植物正常生长的前提下即可明确牡丹中的药效成分丹皮酚在组织细胞水平上的存在部位与相对定量，不仅直观、快捷、准确，而且得到的实验结果可以帮助指导中药材规范化生产与深加工、完善现有丹皮酚的提取工艺，更好地节约并利用药用资源，为生产实践服务。

[0006] 为解决上述技术问题，本发明的技术方案是：

[0007] 一种植物中丹皮酚检测用样品制备方法，包括以下步骤：

[0008] A、清除植株器官样品明显的污物，再用冷水轻轻擦拭直至样品表面清洁；冷水温度为0℃-5℃，为减小水温变化，优选使用冰水混合物；

[0009] B、清洁后的样品放入装有碎冰的保温盒中保存并尽快进行冰冻切片；样品冰冻切片的厚度为25-30μm，粘片后0℃-5℃低温保藏。

[0010] 一种植物中丹皮酚检测方法，使用上述制备方法制备的样品进行检测，使用激光共聚焦显微镜、荧光显微镜、双光子激光扫描共聚焦显微镜进行显微观察并进行图像采集，观察记录所采集图像中荧光的存在部位并使用图像分析软件测定不同部位荧光强度，对植物中丹皮酚进行定位和相对定量检测。

[0011] 与现有技术相比，本发明充分利用丹皮酚的理化性质，通过低温冰水处理后进行冰冻切片，制备的切片使用荧光显微镜、激光共聚焦扫描显微镜、双光子激光共聚焦显微镜等观察并进行丹皮酚的定位与相对定量。本发明方法无需经过繁杂的化学成分提取、染色等过程，最大限度地避免了丹皮酚的流失与弥散，保持了组织细胞结构和成分的原貌，在不影响原植物正常生长的前提下即可明确牡丹中的药效成分丹皮酚在组织细胞水平上的存在部位与相对定量，不仅直观、快捷、准确，而且研究结果可以指导中药材规范化生产与深加工、完善现有丹皮酚的提取工艺，更好地节约并利用药用资源，为生产实践服务。

[0013] 实施例1:

[0014] 一种植物中丹皮酚检测用样品制备方法，包括以下步骤：

[0015] 1、使用制冰机制备颗粒细小、质地松软的碎冰，同时融化为冰水混合物备用；

[0016] 2、用纱布等轻轻擦拭新鲜牡丹植株根部器官样品表面明显的污物，再在冰水混合物中用毛笔轻拂直至根样表面清洁；

[0017] 3、清洁后的样品用铝箔纸包裹后装入塑封袋，放入装有碎冰的保温盒中保存并尽快采用低温恒冷箱冰冻切片法进行冰冻切片，样品冰冻切片的厚度为25μm，粘片后0℃低温保藏；

[0018] 一种植物中丹皮酚检测方法，使用上述制备方法制备的样品进行检测，在双光子激光扫描共聚焦显微镜下，选择激发波长700nm观察所制备切片进行图像采集，观察所采集图像中荧光的存在部位并使用图像分析软件测定不同部位荧光强度，明确丹皮酚的定位和相对定量并进行统计分析。

[0019] 实施例1对新鲜牡丹植株根部器官中丹皮酚的定位和相对定量检测结果如下：

[0020] 丹皮酚分布于牡丹根的周皮木栓层细胞的细胞壁、皮层细胞的细胞质，木质部细胞的细胞壁，其含量（荧光平均强度“观察平均值± 标准差，单位：像素荧光强度( Pixel intensity )”）分别是：周皮68.036±18.120、皮层18.772±7.207、韧皮部0.166±0.143、木质部56.929±16.112；研究结果表明牡丹周皮、木质部的丹皮酚含量较高，皮层中丹皮酚含量较低，韧皮部丹皮酚含量最低。这个结果也从组织化学的角度佐证了生产实践中采用牡丹皮入药的科学性。

[0021] 实施例2

[0022] 除制备的样品使用荧光显微镜观察外，其余同实施例1。

[0023] 实施例3

[0024] 除制备的样品使用激光共聚焦显微镜观察外，其余同实施例1。

[0012] 附图为牡丹根结构示意图，其中1为周皮，2为皮层，3为韧皮部，4为木质部。