一种快速准确鉴定鲟鱼性别的方法   0    0

[0001] 本发明属于分子生物学技术领域，涉及生物的分子检测，具体地涉及一种快速准确鉴定鲟鱼性别的方法。

[0002] 鲟鱼包括鲟属Acipenser和鳇属Huso，是软骨硬鳞下纲中现存唯一的目，素有“活化石”之称，鲟鱼籽酱被誉为“黑色黄金”。我国是最大的鲟鱼养殖国和主要的鲟鱼籽酱出口国，2019年中国鲟鱼子酱出口数量为139.8吨，出口金额为3253.5万美元。然而，鲟鱼生长周期长，性成熟慢，且无明显副性征，在发育早期很难从外观上区分雌雄，通常要在养殖3～4年后才能辨出雌雄，之后将雄鱼淘汰作为商品鱼上市；雌鱼养殖需要持续养殖至7～8年用于鱼籽酱生产，在目前鲟鱼养殖的市场上，不能够依照雌雄性别分别进行集约化养殖或一定性别比例进行饲养，会造成饲养过多雄性个体的资源浪费，增加了养殖成本，阻碍了鲟鱼养殖产业化的快速发展，因此，及早准确的判断鲟鱼的性别，可以减少对雄鱼的饲料投入，节约养殖成本，在生产中就显得十分重要。

[0003] 在生产实践中，关于鲟鱼性别鉴定的主要方法有：(1)超声波法，(2)腹腔外侧手术法，(3)腹腔穿刺法，上述方法都需要鲟鱼性腺发育到一定阶段(3～4年鱼龄)才能鉴定，且在鉴定过程中存在鱼体脱水时间久、操作复杂、鉴定时间长等问题，容易对鱼体造成伤害。近年来，随着分子生物学的高速发展，利用分子鉴定性别的技术日趋流行，相较于传统的鉴定方法，分子鉴定方法采样方便、对生物损伤小、操作简便、结果更准确。已有研究表明鲟鱼为雌雄异体，遗传性别决定系统为ZZ/ZW型，雄性鲟鱼为ZZ，雌性鲟鱼为ZW，因此，利用分子检测方法可以实现在鲟鱼生命早期阶段进行雌雄性别鉴定。现有技术中，专利号为CN201910066586.4的中国专利公开了用于鲟鱼性别鉴定的雌性特异性DNA片段SSM2及应用，专利号为CN201910066600.0的中国专利公开了用于鲟鱼性别鉴定的雌性特异性DNA片段SSM1及应用，专利号CN201910066534.7的中国专利公开了用于雌性施氏鲟特异DNA片段及应用，上述专利提供了一些关于鲟鱼的特异性分子标记片段和引物，可用于鉴定鲟鱼的性别，但是上述专利中公开的片段仅为雌性W染色体上的特异DNA片段，设计的引物仅能扩增出一条带，一旦提取的DNA质量不好、PCR或凝胶电泳操作失误就会导致电泳图不出现条带，而将样本错判为雄性，出现假阴性的情况。在鲟鱼性别分子鉴定方法中，特异性DNA标记是进行性别判断的重要工具，如果能够在W染色体与Z染色体中找到外显子序列相同而内含子序列不同的基因序列，利用这种差异设计特异性引物进行PCR扩增，会出现雌性(ZW)有两个阳性结果，而雄性(ZZ)出现一个阳性结果，这样通过双阳性的结果来判断雌雄，就可以排除假阴性的可能，使结果更加可靠准确。

[0004] 为了解决现有技术中存在的鲟鱼性别样本错判、出现假阴性等技术问题，本发明提供一种快速准确确定鲟鱼性别的方法，通过在鲟鱼的W染色体与Z染色体中找到外显子序列相同而内含子序列不同的基因序列，利用这种差异设计特异性引物进行PCR扩增，通过双阳性结果来判断雌雄，提高鲟鱼性别判断的准确性和稳定性。

[0005] 本发明的技术方案如下：

[0006] 本发明提供一种快速准确鉴定鲟鱼性别的方法，包括以下步骤：

[0007] (1)提取待检测鲟鱼样品的DNA；

[0008] (2)以鲟鱼DNA样品为模板，使用引物F和引物R进行PCR扩增；

[0009] (3)将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测；

[0010] (4)根据电泳结果判断鲟鱼性别，其中扩增产物条带出现573bp和123bp两条带为雌性鲟鱼，扩增产物仅有为123bp一条带的为雄性鲟鱼；

[0011] 所述引物F：5’‑GTGTCATAGCAAAGGGGGTGAA‑3’；

[0012] 所述引物R：5’‑TCACAGGGCCCTACTTATAATGTCT‑3’。

[0013] 进一步地，所述PCR反应体系包括以下成分：2×Taq PCR MaterMix 1.0μL、鲟鱼基因组DNA模板10μL、浓度10μM的引物F 0.4μL、浓度为10μM的引物R 0.4μL和水8.2μL。

[0014] 进一步地，所述PCR扩增的反应程序为：95℃‑4min；94℃‑30s，60℃‑45s，72℃‑45s，循环次数为40次；72℃‑10min，16℃‑forever。

[0015] 进一步地，待监测鲟鱼样品为鲟鱼的尾鳍、背鳍、血液、穿刺液以及口腔分泌物、肠道分泌物拭子。

[0016] 本发明的有益效果在于：

[0017] 1、本发明提供一种快速准确鉴定鲟鱼性别的方法，在鲟鱼W染色体与Z染色体中找到外显子序列相同而内含子序列不同的基因序列，针对特异基因序列设计出特异性引物F和引物R，进行PCR扩增，如果是雌性(ZW)，会出现两个阳性结果，而雄性(ZZ)则出现一个阳性结果，通过双阳性结果进行雌雄的判断，能够排除假阴性的错误，提高鉴定结果准确率。

[0018] 2、本发明提供的鲟鱼性别鉴定方法所需的鲟鱼的样品可以是鲟鱼的尾鳍、背鳍、血液、穿刺液以及口腔分泌物、肠道分泌物等拭子，对于活体鲟鱼基本无伤害。

[0019] 3、本发明提供的鲟鱼性别鉴定方法操作简单、时间短、通用性高，将鲟鱼性别鉴定时间大大提前，即使刚孵化的小鲟鱼也可以做性别鉴定，有利于雌雄鲟鱼分开选育和养殖，提早销售雄鲟鱼，降低鲟鱼的养殖成本，大大推动鲟鱼养殖业的发展。

[0022] 下面结合附图和具体实施例对本发明进行进一步的的说明，下述实施例和附图仅用于示例性说明，不能理解为对本发明的限制；除非特别说明，下述实施例中使用的试剂原料为常规市购或商业途径获得的生化试剂原料，使用的实验仪器均为实验室常规仪器，除非特别说明，下述实施例中使用的方法和设备为本领域常规使用的方法和设备。

[0023] 实施例1引物设计与合成

[0024] 收集已公布的鲟鱼基因组序列，通过多重比对和分析，筛选出W染色体与Z染色体中外显子序列相同，内含子序列不同的特异基因序列，其中W染色体的特异基因序列为SEQ ID NO:3，Z染色体的特异基因序列为SEQ ID NO:4；根据上述序列设计出特异性引物F(基因序列为SEQ ID NO:1)和引物R(基因序列为SEQ ID NO:2)，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，具体引物序列如下：

[0025] 所述引物F：5’‑GTGTCATAGCAAAGGGGGTGAA‑3’；

[0026] 所述引物R：5’‑TCACAGGGCCCTACTTATAATGTCT‑3’。

[0027] 实施例2

[0028] 本发明提供一种快速准确鉴定鲟鱼性别的方法，具体包括以下步骤：

[0029] (1)提取待检测鲟鱼样品的DNA

[0030] 16条4个品种的3龄鲟鱼由福建龙鳇鲟业有限公司提供，分别取待检鲟鱼尾鳍组织样本1cm×1cm，保存于无水乙醇，同时采用解剖法鉴定鲟鱼性别(图1为一例雌鲟鱼和一例雄鲟鱼的性腺图)，解剖鉴定结果如表1所示，利用DNA提取试剂盒提取鲟鱼尾鳍基因组DNA，稀释至50ng/μL保存于‑20℃备用；其中待监测鲟鱼样品为鲟鱼的尾鳍、背鳍、血液、穿刺液以及口腔分泌物、肠道分泌物等拭子；

[0031] (2)以鲟鱼DNA样品为模板，使用引物F和引物R进行PCR扩增

[0032] PCR反应体系：已提取鲟鱼尾鳍基因组DNA为模板，以引物F和引物R为引物进行PCR反应；

[0033] 其中，反应体系为：2×Taq PCR MaterMix 1.0μL、鲟鱼基因组DNA模板1.0μL、浓度10μM的引物F 0.4μL、浓度为10μM的引物R 0.4μL和水2μL；

[0034] PCR扩增的反应程序为：95℃‑4min；94℃‑30s，60℃‑45s，72℃‑45s，循环次数为40次；72℃‑10min，16℃‑forever；

[0035] (3)将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测

[0036] PCR反应结束后，取8μL的PCR扩增产物用质量分数为1.5％的琼脂糖凝胶进行电泳，120V 20min结束后，用紫外凝胶成像系统检测扩增结果，拍照记录；

[0037] (4)鲟鱼性别判断

[0038] 参见图1电泳检测结果显示，雌性鲟鱼尾鳍样品有两条长度分别为573bp和123bp的条带，雄性鲟鱼尾鳍样品只有一条长度为123bp的条带，与预期的目的条带相符，且两条带间距较大，容易判断出待测样品的性别；

[0039] 16条鲟鱼采用本发明分子鉴定性别方法的鉴定结果见表1，其鉴定结果与解剖鉴定的结果一致，说明本发明提供方法具有非常好的特异性。

[0040] 表1 16条鲟鱼性别鉴定结果

[0041]

[0042] 以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。

[0020] 图1为本发明实施例2解剖后一例雌鲟鱼和一例雄鲟鱼的性腺图；

[0021] 图2为本发明本发明实施例2中鲟鱼尾鳍PCR产物凝胶电泳电泳后的图谱；其中，M为Marker，1～16为鲟鱼样本，17为阴性对照